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摘要本文采用回顾性研究、成分分析及体外细胞实验相结合的方法，评价解毒通络调肝方（JieduTongluoTiaoganFormula，JTTF）改善2型糖尿病(type2diabetesmellitus,T2DM)患者的临床疗效，以及探索该方药效的物质基础和生物学内涵，为JTTF治疗T2DM的临床应用和机制研究提供数据支撑和科学依据。<br>　　目的：1.通过回顾性研究方法观察符合纳入标准的T2DM患者，评价JTTF改善患者临床症状和糖脂代谢指标等的情况，评价其临床疗效，为临床运用提供客观依据，以期在临床上为应用JTTF治疗T2DM时的思路及方法提供参考与借鉴。<br>　　2.通过建立JTTF的质量控制方法，明确其药效组分的主要组成及稳定性，并为后续的生物学机制研究提供可靠的实验基础。<br>　　3.采用细胞模型研究JTTF对大鼠胰岛瘤细胞（INS-1细胞）的保护作用，以及对内质网应激、过度自噬的影响，系统阐明该方保护胰岛功能的分子机制，为该方治疗T2DM的分子机制提供理论与实验依据。<br>　　方法：1.通过回顾性分析符合纳入标准的患者283例，分别记录患者在入组和出组时的基本信息情况，以及空腹血糖、餐后血糖、糖化血红蛋白、BMI、脂代谢、主症等综合分析有效性，探讨JTTF治疗T2DM的疗效分析。<br>　　2.采用UPLC-Q-TOF-MS法分析JTTF的主要组成及稳定性；接着，使用JTTF中药冻干粉制剂干预高糖诱导的INS-1细胞，利用MTT、GSIS、WesternBlot、q-PCR等方法来分析该方对细胞糖毒性的保护作用；最后，利用WesternBlot、q-PCR、流式细胞术、荧光化学法等研究该方对高糖诱导的INS-1细胞内质网应激、过度自噬的影响，系统阐明该方保护胰岛功能的分子机制。<br>　　结果：1.通过对服用JTTF患者的糖脂代谢、BMI、临床症状情况的观察，治疗3个月后，从数据分析中显示，JTTF能够改善患者的FBG、2hPBG、HbA1c和脂代谢，同样还具有一定的减轻体重的作用，同时对患者的临床不适症状，尤其是肝胃郁热的主症，有较好的改善，为JTTF的推广提供临床证据，同时也丰富了中医药治疗T2DM的临床经验。<br>　　2.通过UPLC-Q-TOF-MS方法对JTTF化学成分进行定性分析，共推测出28种化学成分，其中包括黄酮类6种、苯丙素类4种、萜类4种、皂苷类3种、碱类3种、蒽醌类2种、有机酸类2种、氨基酸类2种、醛类1种。同时对JTTF中的28种化学成分进行定性鉴别，结果显示，黄酮类化合物主要源自黄芪和榛花，皂苷类化合物主要源自丹参和黄芪，萜类化合物主要源自丹参，苯丙素类化合物主要源自黄芪、柴胡，有机酸类化合物主要源自榛花，氨基酸类化合物主要源自丹参和黄芪，醛类化合物主要源自柴胡。本研究采取UPLC-Q-TOF-MS技术来分析JTTF中化学成分的定性分析，此方法高效、便捷，为JTTF的质量控制方法和药物稳定性研究的提升提供了科学依据。<br>　　3.当用25至500μg/mL的JTTF孵育INS-1细胞48小时，不影响INS-1细胞的存活率，说明JTTF无毒性作用；通过对高糖浓度的筛选，最终确定最佳造模浓度为20mM；通过GSIS实验得出结论，JTTF可以改善β细胞胰岛素分泌，保护胰岛功能；通过对胰岛素基因（INS1、INS2）及胰岛素基因调控因子PDX1及MafA的基因与蛋白的表达，结果显示，高糖可以抑制其基因与蛋白的表达，而JTTF可以增加其mRNA和蛋白的表达（P＜0.01），这表明JTTF对高糖诱导的胰岛β细胞胰岛素合成与分泌具有保护作用。<br>　　4.在高血糖条件下，相关的持续内质网应激（Endoplasmicreticulumstress，ERS）会导致β细胞内Ca2+水平升高，高糖诱导的内质网中Ca2+转运功能障碍导致β细胞持续ERS，进一步导致胰岛β细胞的功能障碍，而JTTF能够抑制其细胞内Ca2+的释放（P＜0.01），保持细胞内稳态；同时，在高糖的环境里，Ca2+转运功能障碍，大量Ca2+外流，Camkkβ被激活，导致胰岛β细胞的损伤，而其损伤能够被JTTF所抑制（P＜0.05）；最后，在高糖的刺激下，胰岛β细胞产生ERS，使PERK、IRE1α、ATF-6与GRP78分离，触发GRP78、PERK、IRE1α和ATF-6蛋白的长期强烈表达，可导致胰岛β细胞功能障碍，JTTF干预后可显著降低GRP78、p-IRE1α、ATF6、p-PERK的蛋白表达（P＜0.01），进而降低胰岛β细胞的功能障碍。<br>　　5.在持续的高血糖状态下，诱发胰岛β细胞内发生持续的ERS，导致过度自噬发生。通过使用Westernblot分析监测β细胞中几种自噬相关蛋白（mTOR、ULK1、Beclin-1、LC3、p62）的水平，结果显示，JTTF治疗能够抑制过度自噬并保护β细胞免受高糖诱导的损伤（P＜0.01）；接着，使用荧光化学法评估β细胞中OA染色自噬体的水平。AO染色结果显示，与对照组相比，48小时接触高糖的模型组细胞中观察到的自噬空泡显著增加，红色荧光增强。JTTF处理后，随着JTTF浓度的增加，自噬空泡呈剂量依赖性减少，红色荧光减弱（P＜0.05）。同时利用自噬的激活剂AICAR，同样验证了该方抑制过度自噬的效果。<br>　　结论：1.本研究通过回顾性分析，阐明了JTTF是治疗T2DM的临床有效方剂，值得推广应用。2.JTTF的药物组分共鉴定出28种，进一步明确了该方的药效成分和药物作用的稳定性。3.在体外实验方面，验证了该方对胰岛β细胞的糖毒性的保护作用。4.JTTF对胰岛β细胞的糖毒性的保护作用可能是通过抑制ERS和细胞过度自噬，保持细胞内稳态。