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摘要植物生物质是地球上最丰富的可再生资源，以其为原料进行生物炼制可生产高附加值产品。丝状真菌分泌的植物生物质降解酶（Plantbiomass-degradingenzyme,PBDE）是生物炼制所需的绿色催化剂，但其产量低严重阻碍了生物炼制的产业化发展。草酸青霉（Penicilliumoxalicum）和嗜松篮状菌（Talaromycespinophilus）在碳源诱导条件下能分泌完整的PBDE。已知真菌PBDE基因的表达受到转录因子（Transcriptionfactor,TF）的严格调控，但对其分子调控机理的认识有限。<br>　　前期工作在草酸青霉菌株HP7-1中敲除了非同源重组相关基因PoxKu70得到菌株ΔPoxKu70，在ΔPoxKu70中敲除了调控主要PBDE生物合成的新关键调控基因PoxCxrA；转录组比较分析发现基因POX01387（命名为PoxCxrC,P.oxalicumcellulaseandxylanaseregulatorC）在突变体?PoxCxrA中的转录水平比在菌株?PoxKu70中的显著上升1.6倍。本研究证实PoxCxrA直接动态调控PoxCxrC的表达。序列比对分析表明GenBank中与PoxCxrC同源的所有蛋白均功能未知；PoxCxrC定位在细胞核且具有转录激活功能，证实其为新TF。<br>　　本研究在ΔPoxKu70中敲除PoxCxrC获得突变体ΔPoxCxrC，构建了ΔPoxCxrC的互补株ΔPoxCxrC::PoxCxrC。相比ΔPoxKu70，转接突变体ΔPoxCxrC到含结晶纤维素（Avicel）或麦麸加稻杆（Wheatbranplusricestraw,WR）的液体培养基中培养2-4天时的滤纸酶和木聚糖酶产量增加42.2%-119.6%；转接到含可溶性玉米淀粉（Solublecornstarch,SCS）的液体培养基中培养2-4天时的淀粉酶产量增加48.9%-81.6%（p＜0.01）。相比ΔPoxKu70，突变体ΔPoxCxrC在含羧甲基纤维素（Carboxylmethylcellulose,CMC）的液体培养基中培养36h-84h时的生物量增多59.2%-93.8%；在含CMC和Avicel的固体培养基中培养11天和5天时的孢子数量分别增加6.2倍和1.6倍（p＜0.01）。互补株的上述表型和ΔPoxKu70的类似。说明PoxCxrC负调控草酸青霉的主要PBDE生物合成和生长发育。<br>　　相比ΔPoxKu70，突变体ΔPoxCxrC在Avicel诱导培养24h时的转录组中有1545个基因的转录水平显著改变，其中关键纤维素酶和木聚糖酶基因cbh1、cbh2、eg1、eg2、Cel12A、bgl1、xyn11A的转录水平提高1.3-2.9倍；关键调控基因和生长发育相关基因POX02484、PoxCxrB、PoxNsdD、brlA、flbD上调41.3%-258.6%（p＜0.01）。EMSA分析发现PoxCxrC直接与上述基因的启动子区结合。说明PoxCxrC直接调控这些基因的表达。<br>　　用Avicel诱导启动子pPoxEgCel5B控制全长PoxCxrC和7段PoxCxrC不同区域（PoxCxrC1-853、PoxCxrC1-417、PoxCxrC1-288、PoxCxrC1-248、PoxCxrC12-924、PoxCxrC200-924和PoxCxrC12-200/248-288）的编码序列并分别置换ΔPoxKu70中一个对PBDE产量无影响的蛋白酶基因获得相应菌株，在Avicel诱导培养4天时，相比ΔPoxKu70，菌株ΔPoxKu70::PoxCxrC1-288和ΔPoxKu70::PoxCxrC12-924的滤纸酶产量分别降低53.9%和87.7%（p＜0.01），但菌株ΔPoxKu70::PoxCxrC1-248、ΔPoxKu70::PoxCxrC200-924和ΔPoxKu70::PoxCxrC12-200/248-288的酶产量和ΔPoxKu70的比无显著差别，表明PoxCxrC12-288是PoxCxrC起正常调控功能所必需的。将PoxCxrC1-288的编码序列导入到ΔPoxCxrC中获得ΔPoxCxrC::PoxCxrC1-288，其滤纸酶产量比ΔPoxCxrC的降低14.0%（p＜0.01），进一步证实PoxCxrC12-288是PoxCxrC的关键功能区域。<br>　　氨基酸序列比对分析发现PoxCxrC包含两段保守寡肽PYQLPPPR（16-23）和LPSVRSLLTP（65-74）。用Avicel诱导启动子pPoxEgCel5B控制缺失不同保守寡肽的PoxCxrC1-288（PoxCxrC1-288?16-23和PoxCxrC1-288?65-74）的编码序列并分别置换ΔPoxKu70中的一个蛋白酶基因获得相应菌株。在Avicel诱导培养4天时，相比ΔPoxKu70，菌株ΔPoxKu70::PoxCxrC1-288?65-74的滤纸酶产量无显著改变，说明PoxCxrC1-288?65-74失去调控功能；菌株ΔPoxKu70::PoxCxrC1-288?16-23的滤纸酶产量降低53.9%（p＜0.01），说明PoxCxrC1-288?16-23具有一定的调控功能。将缺失第65-74位氨基酸的PoxCxrC的编码序列导入到突变体ΔPoxCxrC中获得菌株ΔPoxCxrC::PoxCxrCΔ65-74，其滤纸酶产量与突变体?PoxCxrC的比无显著差异，上述结果证实LPSVRSLLTP（65-74）是关键的。GST-pulldown分析发现PoxCxrC能够形成同源聚体，其缺少第65-74位氨基酸不能形成聚体，说明LPSVRSLLTP（65-74）通过介导PoxCxrC形成聚体发挥关键作用。<br>　　在嗜松篮状菌1-95中发现与PoxCxrC同源性最高的未知功能蛋白TP05746，其与PoxCxrC和PoxCxrC12-288的相似性分别为70.65%和66.55%。在野生型菌株1-95中敲除了非同源重组相关基因TpKu70得到菌株ΔTpKu70，在ΔTpKu70中敲除了基因TP05746。相比ΔTpKu70，转接到含SCS或麦麸加Avicel（WheatbranplusAvicel,WA）的液体培养基中培养2-4天时，突变体ΔTP05746的生淀粉酶、滤纸酶和木聚糖酶产量升高112.9%-323.9%（p＜0.01）；在SCS或WA的诱导下，突变体ΔTP05746的生物量分别增多58.2%-323.6%（24h-60h）和15.8%-31.3%（24h-36h）（p＜0.01）；在含SCS或WA的固体培养基中培养6天时，突变体ΔTP05746的孢子数量分别减少63.4%和52.6%（p＜0.01）。说明TP05746负调控嗜松篮状菌的主要PBDE生物合成和菌丝生长、正调控其分生孢子产生。<br>　　相比ΔTpKu70，突变体ΔTP05746在SCS诱导培养12h时的转录组中有4429个基因的转录水平显著改变，其中关键淀粉酶基因TP03368、amy13A和TP12319以及调控基因TpRfx1和TpAmyR的表达水平上调1.1倍-58.7倍；关键生长发育相关基因VeA、WetA和FlbA的降低56.2%-70.0%（p＜0.01）。EMSA分析发现TP05746直接与上述基因的启动子区结合，说明TP05746直接调控这些基因的表达。<br>　　将TP05746基因导入到草酸青霉ΔPoxKu70中获得菌株ΔPoxKu70::TP05746。在Avicel诱导培养1-3天时，相比ΔPoxKu70，除β-葡萄糖苷酶外，该菌株的淀粉酶、纤维素酶和木聚糖酶产量降低15.6%-84.6%（p＜0.01），表明TP05746在草酸青霉中也具有调控主要PBDE产量的功能。<br>　　综上所述，草酸青霉新TFPoxCxrC通过调控关键PBDE基因及其调控基因和生长发育相关基因的表达抑制主要PBDE的产生和真菌的生长发育。其中关键区域PoxCxrC12-288和保守寡肽LPSVRSLLTP（65-74）是PoxCxrC抑制功能所必需的，LPSVRSLLTP（65-74）通过介导PoxCxrC的聚体化发挥关键作用。此外，在嗜松篮状菌中发现的PoxCxrC同源蛋白TP05746也通过调控关键PBDE基因及其调控基因和生长发育相关基因的表达抑制主要PBDE的产生，并调控真菌的生长发育，且TP05746在草酸青霉中也具有调控功能。这些结果对深入认识丝状真菌PBDE基因表达调控的分子机理提供了新见解，为理性设计、定向遗传改造真菌以提高PBDE产量提供理论指导。