检索历史 清除

摘要背景<br>　　遗传性凝血因子Ⅺ（coagulationfactorⅪ，FⅪ）缺陷症（hereditaryFⅪdefificiency）是由于编码FⅪ的基因发生突变而引起的罕见遗传病。该病临床表现多样，其中少部分患者表现为自发性出血，大多数是由于创伤或手术后出现出血异常。遗传性蛋白C（ProteinC，PC）缺陷症（hereditaryPCdeficiency）是由于编码PC的基因缺陷所致，通常表现为常染色体显性遗传，复合杂合和纯合则是以隐性的方式遗传给下一代。凝血和抗凝系统异常会对机体造成严重的影响。<br>　　目的<br>　　本文对一个遗传性FⅪ缺陷症和一个遗传性PC缺陷症家系进行分子致病机制研究，探讨其发病机制，有利于帮助疾病的诊断、治疗及预防。<br>　　材料和方法<br>　　（一）研究对象<br>　　家系1：先证者，女性，3岁，浙江临海人，因“发热、反复咳嗽”入我院治疗。常规凝血功能检查：活化部分凝血活酶时间（Activatedpartialthromboplastintime，APTT）为80.1s（参考范围：29.0~43.0s），D-二聚体（D-Dimer，D-D）为1.43mg/l（参考范围：0~0.5mg/l），凝血酶原时间（Prothrombintime，PT）和纤维蛋白原（Fibrinogen，FIB）在正常参考范围内。进一步检查，APTT延长可以被20人份正常混匀血浆纠正，同时狼疮抗凝物质（Lupusanticoagulant，LA）阴性，考虑先证者是内源性凝血因子缺陷所致。凝血因子活性检测发现先证者凝血因子Ⅺ活性（coagulationfactorⅪactivity，FⅪ:C）仅5%（参考范围：80~120%），凝血因子Ⅷ活性（coagulationfactorⅧactivity，FⅧ:C）、凝血因子Ⅸ活性（coagulationfactorⅨactivity，FⅨ:C）和凝血因子Ⅻ活性（coagulationfactorⅫactivity，FⅫ:C）均在正常参考范围内，凝血因子Ⅺ抗原（coagulationfactorⅪantigen，FⅪ:Ag）含量为6.7%（参考范围：85~115%）。先证者既往体健，未使用抗凝药物，无明显出血症状。先证者父母否认近亲婚配，其他家系成员（共2代8人）均否认出血与血栓性疾病史。<br>　　家系2：先证者，男性，2天，浙江台州人，以“发现皮肤黄染，下腹部斑块半天”入院。实验室检查显示蛋白C活性（ProteinCactivity，PC:A）为4％（参考范围70-150%），蛋白C抗原（ProteinCantigen，PC:Ag）为5％（参考范围70-150%），FIB为4.96g/L，D-D为1.7mg/l，蛋白S活性（ProteinSactivity，PS:A）、抗凝血酶活性（Antithrombinactivity，AT:A）、纤溶酶原活性（Plasminogenactivity，PLG:A）均未见异常。考虑该患儿为PC缺陷所致的暴发性紫癜，予以低分子肝素治疗，同时输注新鲜冰冻血浆。患儿病情持续恶化，下腹部斑块不断扩大，于出生后第10天死亡。先证者曾有一哥哥，出生后第13天死亡，当时考虑葡萄球菌烫伤样皮肤综合征，症状与先证者极为相似，具体治疗过程不详。先证者父母否认近亲结婚，其他家系成员（共2代4人）否认有出血或血栓病史。<br>　　（二）方法<br>　　1.标本采集<br>　　采集先证者及所有家系成员外周静脉全血2.7ml，用枸橼酸钠1:9抗凝，3000×g离心10min，血浆进行实验室表型检测；下层血细胞用于提取DNA。<br>　　2.凝血功能实验检测<br>　　在STAGO全自动血凝仪上采用凝固法检测PT、APTT、FIB、FⅧ:C、Ⅸ:C、FⅪ:C、FⅫ:C及PS:A；免疫比浊法检测D-D；采用发色底物法检测PC:A、AT:A、PLG:A。采用ELISA法检测FⅪ:Ag和PC:Ag。<br>　　3.基因型检测<br>　　用西唐基因组DNA提取试剂盒抽提所有受试者外周血DNA。根据F11基因序列（GenBank：AY191837）和PROC基因序列（GenBank：AF378903）设计引物，用聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）扩增基因所有外显子及其侧翼区，扩增产物进行测序，并与美国国立生物信息中心（NationalCenterforBiotechnologyInformation，NCBI）提供的序列进行比对，寻找基因突变位点。<br>　　4.克隆测序验证<br>　　针对缺失突变的DNA片段，在PCR扩增后进行电泳切胶回收纯化PCR产物，然后将PCR产物装入克隆载体（FⅪ:pcDNA3.1（+）质粒，美国Addgen公司，批号128744；PC:pUC18质粒，美国Addgene公司，批号50004）；将已连接上缺失突变DNA片段的重组质粒，转化进入DH-5α感受态细胞（法国Transgene公司，批号CD201）；在LB固体培养基上涂布培养，挑取单个白色菌落，接种于5ml含氨苄青霉素（1:1000）的LB液体培养基中，在37℃200r/min，振荡培养16～20h。然后提取重组质粒，用克隆载体通用引物进行PCR扩增，电泳鉴定后进行测序分析。<br>　　5.生物信息学特性分析<br>　　利用MutationTaster生物信息学软件在线分析氨基酸突变对蛋白功能的影响；应用ClustalX-2.1-win软件对氨基酸进行同源物种序列保守性分析；运用Swiss-PdbViewer4.0.1软件，根据蛋白数据库（Proteindatabase，PDB）中发布的FⅪ（pdb：2f83）和PC（pdb：1AUT）蛋白结构模型文件，对突变的蛋白构建模型进行比对，分析突变前后氨基酸分子间作用力及蛋白质结构的改变。<br>　　6.细胞体外表达实验<br>　　用pcDNA3.1（+）质粒载体构建野生型FⅪ表达质粒；用Lipo2000转染试剂将空载型、野生型和突变型质粒（第4步所得）转染COS7细胞和CHO细胞；提取COS7培养细胞内RNA，逆转录PCR以检测基因转录水平；收集纯化COS7上清液和细胞，采用ELISA法检测FⅪ抗原水平；CHO细胞进行荧光染色，在荧光显微镜下进行观察。<br>　　结果<br>　　1.家系1：先证者APTT为80.1s，FⅪ:C为5%，FⅪ:Ag为6.7%；先证者父亲和母亲的APTT均延长，FⅪ:C和FⅪ:Ag为正常对照50%左右；基因分析显示先证者F11基因的第12号外显子存在c.1677_1677delT杂合缺失突变，第9号外显子存在c.1373Ggt;A杂合多态性，分别导致p.Leu442Cysfs*8和p.Glu341Lys。ClustalX-2.1-win软件分析表明Leu442和Glu341在同源物种间高度保守；MutationTaster评估结果显示p.Leu442Cysfs*8突变是致病的，p.Glu341Lys突变是温和的。p.Leu442Cysfs*8突变蛋白模型分析显示，突变前非极性的Leu442与Pro439之间有1条氢键，突变为极性的Cys，与Pro439之间的氢键又增加了1条；p.Glu341Lys模型分析显示，突变前带负电荷的Glu341与带正点荷Lys343之间有1条氢键，突变为Lys后，氨基酸电荷发生改变且侧链变短，与Lys343之间的氢键和空间位阻消失。细胞实验提示p.Leu442Cysfs*8突变影响FⅪ的合成。<br>　　2.家系2：先证者PC:A为4%，PC:Ag为5%，均显著降低；先证者父母和姐姐的PC:A和PC:Ag均低于正常参考范围。基因分析显示先证者PROC基因存在2个杂合突变：第8号外显子存在c.795_796insA杂合缺失突变，导致p.Gly266Argfs*4；第9号外显子存在c.1206_1207insG杂合缺失突变，导致p.Pro405Alafs*20；先证者母亲和姐姐携带了p.Gly266Argfs*4，其父亲携带有p.Pro405Alafs*20。物种同源性分析显示Gly266与Pro405位点在脊椎物种中具有高度同源性。MutationTaster分析显示p.Gly266Argfs*4和p.Pro405Alafs*20的结果分别为0.996和0.997，表明2个缺失突变均为有害突变，可引起疾病。p.Gly266Argfs*4突变蛋白模型分析显示，不带电荷的Gly266突变为带正电荷的Arg266后，与Trp314和Ser312之间分别形成了一条氢键，此外，突变后的侧链延长与Ser312、Thr314、Trp276形成了空间位阻；p.Pro405Alafs*20突变蛋白模型分析显示，Pro405突变为Ala405后，苯环消失。<br>　　结论<br>　　1.家系1：先证者及其父亲和母亲的FⅪ:C和FⅪ:Ag均降低，提示FⅪ缺乏；先证者F11基因存在p.Leu442Cysfs*8和p.Glu341Lys复合杂合突变分别来自于其父亲和母亲，与该患者FⅪ水平降低有关；先证者及家系突变携带者均无自发性出血表现。<br>　　2.家系2：先证者及其父亲、母亲和姐姐的PC:A和PC:Ag均有不同程度降低，表现为PC缺陷症；先证者PROC基因存在p.Gly266Argfs*4和p.Pro405Alafs*20复合杂合突变，分别来自于其母亲和父亲，这些突变与该家系PC水平降低有关；该复合杂合突变可能是先证者出生后10天死于暴发性紫癜的主要病因。<br>　　3.遗传性FⅪ缺陷症家系中p.Leu442Cysfs*8和遗传性蛋白C缺陷症家系中p.Gly266Argfs*4均为国内外首次报道的新突变类型，同时这两个复合杂合突变国内外尚未见报道。