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摘要【研究背景与目的】<br>　　造血贯穿于人的整个生命过程，造血首先发生在卵黄囊（YolkSac）血岛，随后发生在主动脉-性腺中肾区（AortaGonadMesonephros）、胎盘和胎儿肝脏（FetalLiver），最后定位于骨髓，它的建立与维持依赖于自我更新的造血干细胞，涉及到造血干细胞的形成与分化。造血干细胞作为一种罕见的细胞存在于成年哺乳动物的骨髓中，是造血系统的原始细胞,位于造血系统的顶端，它首先分化为各系祖细胞，然后定向增殖分化为各系血细胞和免疫细胞，最终构建整个造血系统。处于不同造血阶段的造血干细胞具有不同的特性，这可能进一步显示了在每个造血阶段支持造血干细胞分化和自我更新的不同生态位，以及每个阶段的造血干细胞的内在特性。造血干细胞的造血稳态到各种因素的调控，其中HSC的分化与代谢密切相关，如氨基酸代谢，脂肪酸代谢等都严格调控着造血干细胞的分化。脂肪酸氧化（FAO）促进造血干细胞的非对称分裂，使之能够产生一个下游分化的祖细胞和一个具有自我更新潜力的子细胞。相反，在FAO受到抑制的条件下，造血干细胞进行对称分裂，产生两个下游的祖细胞。HSC在骨髓中定位于特殊骨髓微环境生态位--niche，在生理状态下生态位中HSC保持着静止状态主要依赖糖酵解作为主要的能量来源，但在其处于分化增殖状态下，线粒体OXPHOS强烈上调，转变为依赖于产能高的线粒体氧化磷酸化。造血干细胞中的糖酵解和线粒体OXPHOS与其他代谢途径(如谷氨酰胺代谢)也相互关联，同时造血干细胞向红细胞系分化依赖于谷氨酰胺运输和代谢。<br>　　在我们课题组前期的实验中发现，在Ptpn11E76K/+突变的骨髓增殖性肿瘤小鼠的骨髓中长期造血干细胞(LT-HSC)、短期造血干细胞(ST-HSC)、多能祖细胞1(MPP1)、多能祖细胞2(MPP2)、多能祖细胞3(MPP3)、多能祖细胞4(MPP4)等这些造血干/祖细胞，相对于对照组小鼠，都明显减少，呈现出一种HSC(造血干细胞)耗竭的状态，而髓系祖细胞(Commonmyeloidprogenitor,CMP)，粒系-单核系祖细胞(Granulocytemonocyteprogenitors,GMP)在Ptpn11E76K/+突变的骨髓增殖性肿瘤小鼠的骨髓细胞中却明显增多。于是我们对Ptpn11E76K/+突变的MPN小鼠的骨髓细胞进行RNA测序，发现有许多种基因相较于对照组小鼠骨髓细胞，在Ptpn11E76K/+突变的骨髓增殖性肿瘤的小鼠骨髓中表达发生了明显的变化，但我们在众多差异基因中筛查发现了Fam210b这种基因在Ptpn11E76K/+MPN小鼠的骨髓细胞中明显下调。前期文献报道，Fam210b是近年来新发现的一种线粒体膜蛋白，为一种抑癌基因，其与肿瘤细胞的能量代谢重编程和侵袭转移密切相关；且它与红细胞分化密切相关，是促红细胞生成素的靶点。同时我们查阅数据库发现Fam210b在人体的各大组织中都有表达，但其在骨髓中有着较高的表达水平，且随着骨髓细胞的分化Fam210b不断递减，这强烈的提示我们Fam210b的表达与血液系统相关。但目前关于Fam210b的研究甚少，关于Fam210b在血液系统中明确的作用及其机制报道更少，尤其是它在造血干细胞中的作用几乎空白，于是我们把注意力转向了Fam210b在血液系统中的作用，它是否也会通过代谢途径影响造血干细胞的形成与分化？针对以上的研究背景，本课题组构建了Fam210b在血液系统特异性敲除的小鼠模型Fam210bfl/fl;Mx1-Cre小鼠，通过血常规检测、流式细胞术等实验技术来检测Fam210bfl/fl;Mx1-Cre小鼠血液系统的变化，进一步探寻Fam210b在造血系统中的作用。<br>　　【研究方法】<br>　　1.构建实验组小鼠模型Fam210bfl/fl;Mx1-Cre,对照组小鼠模型Fam210bfl/fl小鼠，并腹腔注射PIPC，诱导血液系统特异性Cre的表达，进而达到Fam210b在血液系统中特异性的敲除。<br>　　2.剪取小鼠的尾部或者耳朵组织，提取DNA,进行PCR扩增快速基因型鉴定。<br>　　3.RT-qPCR检测Fam210b在小鼠骨髓、外周血及脾脏中的敲除效率。<br>　　4.流式细胞术检测小鼠骨髓、外周血、脾脏中的各系血细胞的变化。<br>　　【实验研究结果】<br>　　1.通过基因型鉴定证实我们获得了实验组小鼠Fam210bfl/fl;Mx1-Cre及实验对照组小鼠Fam210bfl/fl小鼠。<br>　　2.PIPC注射一个月后经血常规检测发现Fam210bfl/fl;Mx1-Cre小鼠的外周血中的淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、红细胞等血细胞并没有明显的改变。<br>　　3.流式细胞术检测发现PIPC注射一个月后的Fam210bfl/fl;Mx1-Cre小鼠外周血中除了中性粒细胞有差异外，其他的外周血中的成熟血细胞也没有明显改变,这一结果基本上与血常规检测一致。<br>　　4.RT-qPCR检测发现在PIPC注射3个月后Fam210b在Fam210bfl/fl;Mx1-Cre小鼠的骨髓中的敲除效率达到了90%多，在脾脏中也达到了70%。<br>　　5.PIPC诱导三个月后，相较于对照组小鼠，Fam210bfl/fl;Mx1-Cre小鼠的骨髓细胞总数、脾脏细胞计数及脾脏重量都没有差异。<br>　　6.PIPC注射三个月后，相较于对照组小鼠，Fam210bfl/fl;Mx1-Cre小鼠骨髓中的原幼红细胞、早幼红细胞、总Ter119+的红细胞都明显减少，而外周血中红细胞却没有改变。<br>　　7.PIPC注射3个月后，相较于对照组小鼠，Fam210bfl/fl;Mx1-Cre小鼠的外周血、脾脏、骨髓中T、B淋巴细胞都没有发生明显改变。<br>　　8.PIPC注射3个月后，相较于对照组小鼠，中性粒细胞在Fam210bfl/fl;Mx1-Cre小鼠的外周血、脾脏、骨髓中都没有发生明显改变。<br>　　9.PIPC注射3个月后，相较于对照组小鼠,单核细胞在Fam210bfl/fl;Mx1-Cre小鼠的外周血、脾脏、骨髓中也无明显改变。<br>　　10.PIPC注射3个月后，相较于对照组小鼠,CMP、GMP、MEP造血祖细胞的细胞数目和百分比在Fam210bfl/fl;Mx1-Cre小鼠中都没有发生明显改变。<br>　　11.PIPC注射3个月后，相较于对照组小鼠，ST-HSC、LT-HSC、MPP1、MPP2、MPP3等造血干/祖细胞在Fam210bfl/fl;Mx1-Cre小鼠骨髓中都明显减少，呈现出一种造血干细胞耗竭状态。<br>　　【结论】<br>　　1.Fam210b在血液系统中特异性的缺失导致小鼠的骨髓中的红细胞明显减少，而外周血中的红细胞却没有明显的改变，这可能由于外周血的代偿作用。<br>　　2.Fam210b在血液系统中特异性的缺失导致小鼠骨髓中的干/祖细胞的数目与百分比明显减少，呈现出一种HSC的耗竭状态。<br>　　3.Fam210b在血液系统中特异性缺失对小鼠的成熟血细胞影响较小，如单核细胞、中性粒细胞、淋巴细胞。