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摘要第一部分拮抗PD-L1促进内皮细胞p-eNOS(Ser1177)表达并增强血管舒张功能<br>　　目的：程序性死亡配体-1（programmeddeathligand-1PD-L1）是一种I型跨膜糖蛋白，除分布于T细胞、B细胞等免疫细胞外，血管内皮细胞也有表达。PD-L1在肿瘤、自身免疫性疾病、感染中发挥重要作用，但PD-L1在内皮细胞中的作用及对内皮功能的影响目前仍不清楚。内皮型一氧化氮合酶（endothelialnitricoxidesynthase，eNOS）是反映内皮功能的重要指标，本部分主要探讨生理状态下PD-L1对于内皮细胞eNOS活性及血管舒张功能的影响。<br>　　方法：体外培养原代人脐静脉内皮细胞（Humanumbilicalveinendothelialcells，HUVECs）、人主动脉内皮细胞（Humanaorticendothelialcells，HAECs）。阿特珠单抗（Atezolizumab）为人源anti-PD-L1单克隆抗体，用阿特珠单抗（不同浓度处理组及处理不同时间组）处理HUVECs、HAECs，Westernblot检测HUVECs、HAECs中eNOS、p-eNOS（Ser1177）、p-eNOS（Ser633）、p-eNOS（Thr495）蛋白表达。在体内，利用anti-PD-L1单克隆抗体腹腔注射C57小鼠，Westernblot检测主动脉、肠系膜动脉eNOS、p-eNOS（Ser1177）、p-eNOS（Ser633）、p-eNOS（Thr495）蛋白表达，用血管张力实验检测主动脉、肠系膜动脉血管舒张功能。RT-qPCR检测小鼠血管IL-1β、IL-1α、TNF-α、iNOS的mRNA表达水平。<br>　　结果：阿特珠单抗呈浓度、时间依赖性增加HUVECs、HAECs中p-eNOS（Ser1177）蛋白表达。在体内，anti-PD-L1单克隆抗体促进主动脉、肠系膜动脉中p-eNOS（Ser1177）蛋白表达，呈剂量及时间依赖性。同时，anti-PD-L1单克隆抗体增强主动脉、肠系膜动脉血管内皮依赖性舒张功能。anti-PD-L1单克隆抗体不引起小鼠血管IL-1β、IL-1α、TNF-α、iNOS的mRNA表达水平变化。<br>　　结论：生理状态下，拮抗PD-L1促进p-eNOS（Ser1177）蛋白表达，激活eNOS，并增强小鼠血管内皮依赖性舒张功能。<br>　　第二部分拮抗PD-L1促进内皮细胞迁移及血管生成<br>　　目的：血管生成是指血管内皮细胞从已有的血管中分化、迁移并生成新生血管的过程，eNOS激活能促进内皮细胞迁移及血管生成。之前的研究表明PD-L1能影响内皮eNOS的活性，但PD-L1对血管生成影响仍不清楚，本部分主要探讨PD-L1对内皮细胞的迁移、血管生成的影响及机制。<br>　　方法：体外培养HUVECs，分为对照组、阿特珠单抗处理组、阿特珠单抗+一氧化氮合酶抑制剂（nitro-l-argininemethylester，L-NAME）组。划痕实验检测对照组、阿特珠单抗处理组细胞的迁移能力，Matrigel胶成血管实验检测以上三组细胞的体外成血管能力。不同浓度的阿特珠单抗处理HUVECs，CCK8检测各组HUCECs增殖能力。<br>　　结果：1.CCK8法检测细胞增殖能力，结果发现各组细胞的吸光度无明显差异，pgt;0.05，无统计学意义；2.划痕细胞结果：阿特珠单抗处理组较对照组划痕区细胞数量明显增多，愈合面积明显增大（36±3.3%VS57±2.45%plt;0.01），二者具有统计学意义；3.体外Matrigel胶成血管实验：阿特珠单抗处理组较对照组的成血管能力明显增加，成管长度约为对照组的1.5倍（plt;0.01），具有统计学意义，但给予L-NAME抑制一氧化氮合酶（nitricoxidesynthase，NOS）后，阿特珠单抗的促血管生成能力被抑制，成管长度仅为阿特珠单抗组的一半（plt;0.01），同样具有统计学意义。<br>　　结论：生理状态下，阿特珠单抗促进HUVECs迁移，并通过激活eNOS促进HUVECs血管生成。<br>　　第三部分敲低PD-L1通过激活eNOS促进小鼠下肢缺血后血管生成<br>　　目的：本部分利用腺相关病毒构建特异性敲低内皮细胞PD-L1小鼠（AAV-PD-L1），并以此作为研究对象，建立小鼠下肢动脉缺血模型，探讨缺氧对内皮细胞PD-L1表达的影响及敲低PD-L1对血管生成的影响及机制。<br>　　方法：细胞实验：体外培养原代HUVECs，利用缺氧孵箱低氧处理HUVECs12h后，Westernblot检测HUVECs中PD-L1蛋白表达变化。动物实验：建立C57小鼠下肢股动脉结扎缺血模型，48h后取结扎侧腓肠肌；假手术组（Sham）组不进行股动脉结扎及离断处理。通过Westernblot法检测手术组及Sham组腓肠肌内PD-L1蛋白表达，免疫组化分析PD-L1的来源。使用腺相关病毒感染小鼠内皮细胞，特异性敲低内皮细胞PD-L1，构建AAV-PD-L1小鼠，并分组：病毒空载体组（GFP）、AAV-PD-L1组、AAV-PD-L1+L-NAME组，分别建立小鼠下肢动脉缺血模型。利用激光多普勒仪检测下肢动脉血流灌注及恢复情况，28天后肉眼观察趾端血供，并取缺血侧腓肠肌组织，利用免疫组化标记CD31，分析腓肠肌毛细血管密度，Westernblot检测血管生成蛋白VEGF、VEGFR2蛋白表达。建立基质胶栓（Matrigelplug）血管生成实验动物模型，通过HE染色计算基质胶栓中的微血管密度，评估GFP、AAV-PD-L1两组小鼠的血管内皮细胞在基质胶栓中的血管生成情况。体外动脉环出芽实验评估出芽率。<br>　　结果：1.与对照组相比，经缺氧处理后，HUVECs中PD-L1蛋白表达明显增加，plt;0.01。同时，小鼠股动脉结扎48h后，相比Sham组,手术组缺血侧腓肠肌PD-L1水平显著增加，免疫组化进一步提示PD-L1分布于内皮细胞，PD-L1的蛋白增加主要来源于内皮细胞；2.利用腺相关病毒敲低内皮细胞PD-L1后，激光多普勒仪提示AAV-PD-L1组小鼠下肢动脉血流灌注恢复快于GFP组，plt;0.05，具有统计学意义。同时肉眼可见GFP组小鼠趾端发黑，AAV-PD-L1组小鼠趾端红润。免疫组化结果显示AAV-PD-L1组小鼠下肢缺血侧腓肠肌毛细血管密度（CD31阳性区）明显高于GFP组；3.体内基质胶栓HE结果表明AAV-PD-L1组小鼠基质胶内微血管密度、血管生成情况显著高于GFP组；AAV-PD-L1组小鼠动脉环出芽率也明显高于GFP组；4.利用L-NAME抑制小鼠体内NOS活性后，AAV-PD-L1组小鼠的促血管生成作用被抑制，具体表现为：激光多普勒仪提示AAV-PD-L1+L-NAME组下肢血流灌注情况明显慢于AAV-PD-L1组，同时趾端发黑、溃烂，下肢缺血侧腓肠肌毛细血管密度（CD31阳性区）明显低于AAV-PD-L1组。<br>　　结论：缺氧促进内皮细胞PD-L1表达，敲低内皮细胞PD-L1通过激活eNOS促进小鼠下肢缺血后血管生成。<br>　　第四部分PD-L1调控eNOS的机制研究<br>　　目的：前面的研究已经证实PD-L1可通过调节eNOS活性促进血管生成，但PD-L1调控eNOS的具体机制仍不清楚，本部分主要探讨PD-L1调控eNOS的机制。<br>　　方法：体外培养HUVECs，阿特珠单抗处理HUVECs，Westernblot检测p-eNOS(Ser1177)、Akt、Akt(S473)、Akt(T308)、PKA、p-PKA、AMPK、p-AMPK蛋白表达。随后应用pp242(p-Akt(S473)抑制剂)、GSK2334470(p-Akt(T308)抑制剂)、H89(PKA抑制剂)，分为对照组、阿特珠单抗组、阿特珠单抗+抑制剂组，Westernblot检测p-eNOS(Ser1177)、Akt、Akt(S473)、Akt(T308)、PKA、p-PKA的蛋白表达。<br>　　结果：阿特珠单抗促进p-eNOS(Ser1177)表达的同时，伴随Akt(S473)、Akt(T308)、p-PKA表达水平的增加，给予pp242、GSK2334470、H89抑制Akt及PKA的活性后，p-eNOS(Ser1177)的表达明显降低。<br>　　结论：PD-L1通过Akt、PKA途径调节eNOS活性。