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摘要背景:头颈部鳞状细胞癌（HeadandNeckSquamousCellCarcinoma,HNSCC）是全球第六大恶性肿瘤，每年导致约35万人死亡。近年来，尽管在多学科综合治疗及靶向免疫治疗等方面取得了一定进展，但患者预后仍然较差，其中颈淋巴结转移是导致头颈鳞癌患者预后不良的重要原因。因此，阐明头颈鳞癌发生和转移的分子机制对于改善患者预后和制定靶向治疗策略具有重要意义。N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine，m6A）修饰是现阶段发现的真核生物体内最广泛的可逆RNA表观遗传修饰方式，RNA甲基转移酶（“writer”）和去甲基转移酶（“eraser”）可动态调控RNA中的腺嘌呤第6位上的氮原子进行甲基化修饰，并在多种m6A结合蛋白（“reader”）的介导下调控RNA的可变剪接、定位、翻译等过程。在这个动态可逆的过程中，m6A修饰RNA的命运和生物学功能主要依赖于“reader”。IGF2BP2作为一种新发现的“reader”蛋白，可通过靶向识别m6A修饰的mRNA并增强其稳定性。目前已有报道发现IGF2BP2可以调控某些肿瘤的进展，但IGF2BP2及其介导的m6A相关调控在头颈鳞癌中的功能作用与机制却尚未有研究报道。<br>　　目的:研究IGF2BP2在头颈鳞癌患者中的表达情况以及与临床预后的相关性；探究IGF2BP2在头颈鳞癌淋巴结转移中的生物学作用；以及IGF2BP2与Slug间的相互作用分子机制，以阐明IGF2BP2调控EMT的全新分子机制；通过构建足垫成瘤-腘窝淋巴结转移裸鼠模型，研究靶向IGF2BP2是否可成为伴有淋巴结转移的头颈鳞癌患者新的治疗靶点，为精准治疗提供新的思路。<br>　　方法:1.利用TCGA数据库、GEPIA2在线网站、R语言等生物信息学技术分析m6A相关调节因子在头颈鳞癌中的表达和总生存率；利用临床组织标本验证IGF2BP2在头颈鳞癌肿瘤组织中的表达模式，并进一步分析IGF2BP2的表达与头颈鳞癌患者预后和临床病理特征的相关性。<br>　　2.通过小干扰RNA或慢病毒感染技术构建敲低或稳定过表达IGF2BP2的头颈鳞癌细胞系；利用RT-qPCR和蛋白质印迹法验证转染效率，并通过细胞划痕实验和Transwell实验明确IGF2BP2对头颈鳞癌细胞迁移和侵袭能力的影响。<br>　　3.利用FaDu细胞株构建足垫成瘤-腘窝淋巴结转移裸鼠模型；通过慢病毒感染技术构建稳定沉默IGF2BP2的FaDu细胞株并利用RT-qPCR和蛋白质印迹法验证转染效率；利用小动物活体成像、免疫组化染色等体内实验进一步明确IGF2BP2对头颈鳞癌淋巴转移及微淋巴管生成的影响。<br>　　4.利用TGF-β诱导建立EMT细胞模型，通过倒置显微镜、免疫荧光染色和共聚焦显微镜观察细胞形态的改变；同时利用蛋白质印迹法检测E-Cadherin的表达，验证EMT细胞模型构建成功。<br>　　5.利用RT-qPCR和蛋白质印迹法检测沉默或过表达IGF2BP2的头颈鳞癌细胞系中EMT标志物E-Cadherin、N-Cadherin和Vimentin的表达情况，以明确IGF2BP2在EMT过程中的作用。<br>　　6.利用TCGA数据库、头颈鳞癌细胞系和临床组织样本分析Slug与IGF2BP2在头颈鳞癌中的表达关系，以明确Slug在IGF2BP2调节EMT过程中的作用。<br>　　7.利用RIP-qPCR、MeRIP-qPCR等技术验证IGF2BP2与Slug之间的直接相互作用，并通过SRAMP分析软件预测m6A修饰位点，荧光素酶报告基因和mRNA稳定性等实验进一步明确IGF2BP2调控Slug的m6A依赖性。<br>　　结果：<br>　　1.20个m6A调节因子在头颈鳞癌中普遍高表达，其中只有IGF2BP2的高表达与头颈鳞癌患者较低生存率相关；与癌旁正常组织相比，IGF2BP2在头颈鳞癌肿瘤组织中过表达；与不伴淋巴结转移的组织相比，伴有淋巴结转移的头颈鳞癌肿瘤组织中IGF2BP2呈高表达；IGF2BP2的高表达与头颈鳞癌淋巴转移和不良预后显著相关，并且是头颈鳞癌患者预后的独立危险因素。<br>　　2.体外功能实验：与si-NC组相比，si-IGF2BP2#2组和si-IGF2BP2#3组细胞中IGF2BP2的mRNA和蛋白质水平均显著降低；与vector组相比，IGF2BP2在FaDu和SCC15细胞中的表达被成功上调。细胞划痕和Transwell实验结果显示：与si-NC组相比，si-IGF2BP2#2组和si-IGF2BP2#3组细胞的迁移侵袭能力明显受到抑制；而较vector组相比，IGF2BP2组细胞的迁移侵袭能力显著增强。<br>　　3.体内动物实验：与sh-NC组相比，sh-IGF2BP2组细胞中IGF2BP2的mRNA和蛋白质水平均显著降低；体内生物发光成像结果显示，沉默IGF2BP2显著抑制了头颈鳞癌细胞的淋巴结转移；体积和重量分析显示，与sh-NC组相比，sh-IGF2BP2组的足垫肿瘤和腘窝淋巴结的体积和重量都要更小、更轻；免疫组化染色分析显示沉默IGF2BP2显著降低了小鼠组织肿瘤内及肿瘤周围区域的微淋巴管密度。<br>　　4.使用10ng/ml的TGF-β处理FaDu和SCC15细胞72h后，倒置显微镜观察到细胞与细胞接触丧失，细胞形态由铺路石样变成以间充质细胞为特征的梭形或纺锤形；免疫荧光染色和共聚焦成像分析显示细胞形成广泛的丝状伪足和片状伪足；蛋白质印迹分析显示TGF-β诱导的头颈鳞癌细胞中E-Cadherin的表达显著降低，表明EMT细胞模型构建成功。<br>　　5.RT-qPCR和蛋白质印迹分析显示沉默IGF2BP2后上皮标志物E-Cadherin表达升高，而N-Cadherin和Vimentin间质标志物下调；而过表达IGF2BP2后，不论在mRNA还是蛋白质水平，E-Cadherin的表达都有所降低，而Vimentin和N-Cadherin的表达含量均明显增加。免疫荧光染色和共聚焦成像分析结果显示敲低IGF2BP2后显著抑制Vimentin的表达，而E-Cadherin的表达明显上调。<br>　　6.Spearman相关性分析显示在头颈鳞癌中EMT关键转录因子Slug和IGF2BP2之间的相关性最强，并且与Slug表达呈显著正相关；RT-qPCR和蛋白质印迹分析显示，沉默IGF2BP2显著降低了FaDu和SCC15细胞中Slug的mRNA和蛋白质水平，而过表达IGF2BP2后Slug的表达水平显著上调。蛋白质印迹分析的结果表明，Slug敲低拮抗了FaDu细胞中由IGF2BP2过表达诱导的Vimentin的上调和E-Cadherin的下调，相反，过表达IGF2BP2部分逆转了由Slug抑制引起的Vimentin下调和E-Cadherin上调。免疫组化染色结果显示，IGF2BP2高表达组中伴随着Slug的高表达，而IGF2BP2低表达组中显示较低的Slug表达，量化评分显示IGF2BP2和Slug的表达呈显著的正相关性（r=0.752，plt;0.001）。<br>　　7.RIP-qPCR实验结果显示，在FaDu和SCC15细胞中与IgG阴性对照组相比，IGF2BP2组显著富集SlugmRNA；MeRIP-qPCR实验结果显示，敲低IGF2BP2显著降低了Slug的m6A修饰水平；SRAMP分析软件的预测结果显示，在SlugmRNA上的CDS区域存在一个非常高置信度的m6A单碱基修饰位点；荧光素酶报告基因实验结果显示，沉默IGF2BP2后，FaDu和SCC15细胞中Slug-WT中的荧光素酶活性显著减弱，而Slug-Mut的荧光素酶活性几乎不受影响；mRNA稳定性实验结果显示沉默IGF2BP2后Slug的mRNA半衰期持续下降。<br>　　结论：我们的研究首次揭示了IGF2BP2在头颈鳞癌淋巴转移中的临床意义和生物学功能，并证明IGF2BP2通过以m6A依赖性的方式稳定SlugmRNA来促进细胞的迁移、侵袭和EMT。这些结果表明IGF2BP2可以作为淋巴转移的预测生物标志物和头颈鳞癌患者抗转移治疗的潜在靶标。