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摘要第一部分惊厥持续状态后幼鼠脑内AMIGO3和Lingo-1的动态变化<br>　　目的：建立幼年小鼠惊厥持续状态（StatusConvulsion,SC）模型，分析SC后不同时期幼鼠脑内AMIGO3和Lingo-1的动态变化。<br>　　方法：选取C57/BL6幼鼠（生后21天龄，P21），予以腹腔注射海人酸建立SC模型；设置同龄对照组（P22，P24，P25和P41），分别于SC后1天，3天，5天和20天，采用免疫荧光检测AMIGO3和Lingo-1蛋白在幼鼠海马内的分布情况；Westernblotting和ELISA检测幼鼠皮层内AMIGO3和Lingo-1蛋白的变化情况；RT-qPCR检测幼鼠海马内AMIGO3和Lingo-1mRNA的变化情况。<br>　　结果：（1）在SC后1天和20天，幼鼠海马内CA1、CA3和DG区分布着大量的AMIGO3和Lingo-1蛋白，与同龄对照组相比，AMIGO3和Lingo-1蛋白分布的轨迹和区域一致。（2）Westernblotting检测显示：幼鼠皮层内AMIGO3蛋白表达在SC后7天与同龄对照组相比明显增加（1.54±0.10vs1.16±0.07,Plt;0.05），而Lingo-1蛋白表达在SC后1天，3天和20天与同龄对照组相比虽有增加趋势，但并未显示出统计学差异（P＞0.05）；ELISA检测显示：幼鼠皮层内Lingo-1蛋白表达在SC后1天（23.96±1.15vs15.84±1.27，ng/g），3天（24.08±1.69vs17.96±1.28，ng/g），7天（29.91±1.55vs22.29±0.87，ng/g）和20天（22.68±0.64vs17.25±0.82，ng/g）与同龄对照组相比均明显增加（Plt;0.05）。幼鼠皮层内AMIGO3蛋白表达在SC后3天（57.76±3.13vs39.66±3.00，ng/g），7天（57.95±2.61vs38.04±3.18，ng/g）和20天（66.02±2.99vs44.67±2.93，ng/g）与同龄对照组相比明显增加（Plt;0.01）。（3）幼鼠海马内Lingo-1mRNA表达在SC后1天，3天，7天和20天与同龄对照组相比并无显著差异（P＞0.05）；幼鼠海马内AMIGO3mRNA表达在SC后3天与同龄对照组相比明显增加（1.44±0.19vs0.91±0.11，Plt;0.05）。<br>　　结论：SC后急慢性期幼鼠皮层内AMIGO3蛋白表达显著增加，与Lingo-1蛋白在幼鼠海马内分布轨迹和区域一致，提示AMIGO3蛋白也参与了SC后未成熟脑损伤的病理过程。<br>　　第二部分调控AMIGO3蛋白表达腺病毒载体构建及转染验证<br>　　目的：构建调控AMIGO3蛋白表达的腺病毒载体，并验证其经侧脑室注射至幼鼠脑内的功能。<br>　　方法：采用RNA干扰技术构建过表达和干扰AMIGO3蛋白表达的腺病毒载体。将构建成功的腺病毒载体注射至幼年C57/BL6小鼠（P21）侧脑室内，用免疫荧光检测腺病毒携带的荧光蛋白GFP表达情况；然后用过表达AMIGO3蛋白腺病毒载体（pSE4551）、三种干扰AMIGO3蛋白表达的腺病毒载体（pAVE3001，pAVE3002和pAVE3003）和阴性对照腺病毒载体转染幼鼠，设置同龄对照组(P22,P24,P26和P28），分别于转染后1天，3天，5天和7天采用ELISA检测幼鼠皮层内AMIGO3蛋白表达情况，验证不同种类腺病毒对AMIGO3蛋白的调控作用，并筛选出抑制效率最佳的干扰AMIGO3蛋白表达腺病毒用于下一步实验。<br>　　结果：（1）腺病毒载体转染7天后仍可在幼鼠脑内观察到GFP蛋白表达。（2）注射过表达AMIGO3腺病毒pSE4551后1天（75.72±5.8vs42.64±5.59，ng/g），3天（75.31±4.27vs48.29±6.87，ng/g），5天（88.9±3.68vs43.17±4.78，ng/g）和7天（95.95±1.81vs44.98±4.38，ng/g），幼鼠皮层内AMIGO3蛋白与同龄对照组相比均显著增加（Plt;0.05）。（3）注射干扰腺病毒pAVE3003后1天（58.78±1.30vs86.00±4.11）、5天（57.40±7.04vs91.36±6.96）和7天（49.71±3.49vs76.57±6.80），幼鼠皮层内AMIGO3蛋白表达较同龄对照组显著降低（Plt;0.05）；注射干扰腺病毒pAVE3001后5天（60.45±5.82vs91.36±6.96），幼鼠皮层内AMIGO3蛋白表达较同龄对照组明显减少（Plt;0.05）；注射干扰腺病毒pAVE3002后1天、3天、5天和7天，幼鼠皮层内AMIGO3蛋白表达较同龄对照组无显著变化（P＞0.05）。<br>　　结论：过表达或干扰AMIGO3蛋白表达的腺病毒载体可成功转染幼鼠脑细胞；侧脑室注射后1天即可明显增加或降低幼鼠皮层内AMIGO3蛋白的表达，其效果至少可持续一周；干扰腺病毒pAVE3003对幼鼠皮层内AMIGO3蛋白表达的抑制作用最佳。<br>　　第三部分调控AMIGO3蛋白表达对幼鼠脑内异常神经环路的影响<br>　　目的：探讨调控AMIGO3蛋白表达是否能改善持续惊厥状态后幼鼠脑内神经元轴突、髓鞘及突触损伤。<br>　　方法：采用过表达AMIGO3蛋白腺病毒载体（pSE4551）、干扰AMIGO3蛋白表达腺病毒载体（pAVE3003）和阴性对照腺病毒载体分别转染幼年C57/BL6小鼠（P21），于侧脑室注射5天（P26）后AMIGO3蛋白表达水平明显改变时，采用腹腔注射海人酸建立SC动物模型。按照转染病毒的不同，分别设立pSE4551+SC组（OAV+SC）、pAVE3003+SC组（AV+SC）和阴性对照+SC组（NC+SC），此外设置正常同龄对照组和SC模型组（P27，P31和P46），分别于SC后1天、5天和20天，采用透射电镜观察各组幼鼠海马内髓鞘和突触结构改变；Westernblotting检测各组幼鼠皮层内MBP、NogoA、MOG、MAG、GluR1、GluR2、GluR3和GluR4蛋白的表达情况。<br>　　结果：（1）与同龄对照组相比，SC后急慢性期可见幼鼠海马内髓鞘分层、塌陷、空泡化，轴突线粒体肿胀；抑制AMIGO3蛋白表达后能减轻SC后急慢性期幼鼠海马内髓鞘结构损害；促进AMIGO3表达后加重SC后急慢性期幼鼠海马内髓鞘结构损害。（2）促进或抑制AMIGO3蛋白表达后幼鼠海马内神经元髓鞘厚度与SC组相比无明显改变。（3）在SC后20天，幼鼠皮层内MBP蛋白表达与同龄对照组相比明显减少（1.09±0.09vs1.81±0.18，Plt;0.05）；与SC组相比，抑制AMIGO3蛋白表达在SC后1天（1.28±0.14vs1.12±0.18）和5天（1.13±0.07vs1.54±0.23）能够明显增加幼鼠皮层内MBP蛋白表达（Plt;0.05）。（4）幼鼠皮层内MAG表达在SC后1天（2.41±0.31vs1.06±0.20）和5天（1.77±0.17vs0.87±0.06）与同龄对照组相比显著增加（Plt;0.05）；促进AMIGO3蛋白表达后幼鼠皮层内MOG蛋白表达在SC后20天较SC组明显增加（1.75±0.06vs1.18±0.09，Plt;0.05）。（5）幼鼠海马内突触数目在SC后1天（7.75±0.48vs17.25±0.85，个/视野）和5天（5.5±0.28vs14.25±1.11，个/视野）与同龄对照组相比显著减少（Plt;0.05）；抑制AMIGO3蛋白表达后幼鼠海马内突触数目在SC后1天（6.75±1.10vs7.75±0.48，个/视野）和5天（7.50±0.64vs5.5±0.28，个/视野）较SC组显著增加（Plt;0.05）。（6）幼鼠海马内PSD厚度在SC后1天（21.41±0.93vs31.57±1.25，nm），5天（14.91±0.49vs21.68±0.71，nm）和20天（26.46±0.96vs35.63±0.75，nm）与同龄对照组相比均明显减小（Plt;0.05）；促进AMIGO3蛋白表达后幼鼠海马内PSD厚度在SC后20天较SC组变薄（22.65±0.33vs26.46±0.96，nm，Plt;0.05）；抑制AMIGO3蛋白表达在SC后5天（22.21±0.55vs14.91±0.49，nm）和20天（36.3±1.18vs26.46±0.96，nm）可见幼鼠海马内PSD厚度增加（Plt;0.05）。（7）幼鼠海马内突触前膜活性带长度在SC后20天较同龄对照组显著增加（596.9±26.75vs319.5±33.89，nm，Plt;0.05）；促进AMIGO3蛋白表达在SC后1天幼鼠海马内突触前膜活性带长度较SC组显著增加（592.0±30.4vs351.6±9.01，nm，Plt;0.05）；抑制AMIGO3蛋白表达在SC后1天（230.1±12.27vs351.6±9.01，nm）和20天（410.2±12.53vs596.9±26.75，nm）活性带长度较SC组显著减少（Plt;0.05）。（8）在SC后1天，5天和20天，幼鼠皮层内GluR1、GluR2、GluR3和GluR4蛋白表达较同龄对照组无显著改变（P＞0.05）；促进或抑制AMIGO3蛋白表达后幼鼠海马内GluR1、GluR2、GluR3和GluR4表达较SC组无明显改变（P＞0.05）。<br>　　结论：SC后急性期幼鼠皮层内轴突损伤因子表达增多，且SC后急慢性期幼鼠海马内髓鞘及突触超微结构可见明显损伤；抑制AMIGO3蛋白表达，可减轻幼鼠SC后急性期髓鞘和突触结构损伤；促进AMIGO3蛋白表达，可使幼鼠皮层内轴突损伤因子表达增多，加重SC后急慢性期幼鼠海马内突触超微结构损害。<br>　　第四部分AMIGO3引起幼鼠脑内异常神经环路形成的作用机制<br>　　目的：探索AMIGO3蛋白引起幼鼠脑内异常神经环路形成的机制。<br>　　方法：采用过表达AMIGO3蛋白腺病毒载体（pSE4551）、干扰AMIGO3蛋白表达腺病毒载体（pAVE3003）和阴性对照腺病毒载体分别转染幼年C57/BL6小鼠（P21），于侧脑室注射5天（P26）后AMIGO3蛋白表达水平明显改变时，采用腹腔注射海人酸建立SC动物模型。按照转染病毒的不同，分别设立pSE4551+SC组（OAV+SC）、pAVE3003+SC组（AV+SC）和阴性对照+SC组（NC+SC），此外设置正常同龄对照组和SC模型组（P27，P31和P46），分别于SC后1天、5天和20天，采用ELISA检测SC后各组幼鼠皮层中p-AKT，AKT，p-RhoA和RhoA的变化情况，计算出p-AKT/AKT和p-RhoA/RhoA比值。<br>　　结果：（1）幼鼠皮层内p-AKT蛋白表达在SC后5天（9.74±0.53vs14.43±0.53，μmol/L）和20天（8.88±0.50vs13.2±0.65，μmol/L）较同龄对照组明显降低（Plt;0.05）；幼鼠皮层内AKT蛋白表达在SC后5天(19.15±0.91vs24.75±0.81，μmol/L)和20天(15.75±0.89vs23.49±0.81，μmol/L)较对照组降低（Plt;0.05）；抑制AMIGO3蛋白表达后幼鼠皮层内p-AKT蛋白表达在SC后20天较SC组明显增加（11.91±0.74vs8.88±0.50，μmol/L，Plt;0.05）；抑制AMIGO3蛋白表达后幼鼠皮层内AKT蛋白表达在SC后20天较SC组明显增加（23.44±0.41vs15.75±0.89，μmol/L，Plt;0.05）；与SC组相比，在SC后1天，5天和20天，抑制或促进AMIGO3蛋白表达对幼鼠皮层内p-AKT/AKT比值无显著影响（P＞0.05）。（2）幼鼠皮层内p-RhoA蛋白表达在SC后1天（4489±276.3vs2719±284.8，pg/g）和20天（6438±295.0vs3404±515.1，pg/g）较同龄对照组显著增加（Plt;0.05），幼鼠皮层内RhoA蛋白表达在SC后20天较同龄对照组显著增加（14489±883.7vs9156±455.8，pg/g，Plt;0.05）；抑制AMIGO3蛋白表达后幼鼠皮层内RhoA表达在SC后1天（2993±173.4vs4489±276.3，pg/g）和20天（2196±311.7vs3404±515.1，pg/g）较SC组显著减少（Plt;0.05）。抑制AMIGO3蛋白表达后幼鼠皮层内p-RhoA蛋白表达在SC后5天（8736±773.3vs13796±628.9，pg/g）和20天（8561±652.2vs14489±883.7，pg/g）较SC组显著减少（Plt;0.05）；促进AMIGO3蛋白表达后幼鼠皮层内RhoA蛋白表达在SC后1天较SC组显著增加（14390±410.8vs9334±792.4，pg/g,Plt;0.05），促进AMIGO3蛋白表达后幼鼠皮层内p-RhoA表达在SC后5天显著增加（6332±314.6vs4671±374.7，pg/g，Plt;0.05）；抑制AMIGO3蛋白表达后幼鼠皮层内p-RhoA/RhoA比值在SC后20天较SC组显著降低（0.25±0.02vs0.45±0.03，pg/g，Plt;0.05）。<br>　　结论：抑制或促进AMIGO3蛋白表达对SC后急慢性期幼鼠皮层内PI3K/AKT信号通路并无显著影响；抑制AMIGO3蛋白表达可下调SC后慢性期幼鼠皮层内ROCK/RhoA信号通路。