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摘要目的：探讨肿瘤细胞外囊泡（sEVs）调控CD8+T细胞肌酸代谢重塑在NPM1突变白血病免疫逃逸中的作用以及分子机制。<br>　　方法：（1）收集良性血液疾病患者、NPM1非突变AML患者与NPM1突变AML患者骨髓液，免疫组织化学分析中不同类型T细胞所占比例；分离培养原代CD8+T细胞，CFSE实验检测CD8+T细胞增殖能力，ELISA实验检测CD8+T细胞IL-2和IFN-γ的释放量，细胞流式分析技术检测CD8+T细胞CD25和GranzymeB的表达量；患者血清与CD8+T细胞共培养，细胞流式分析技术检测CD8+T细胞IL-2、IFN-γ、CD25和GranzymeB的表达量；白血病细胞（NB4、OCI/AML2和OCI/AML3）与CD8+T细胞共培养，CFSE实验检测CD8+T细胞增殖能力，ELISA实验检测CD8+T细胞IL-2和IFN-γ的释放量，细胞流式分析技术检测CD8+T细胞CD25和GranzymeB的表达量。（2）将细胞外囊泡（sEVs）释放抑制剂GW4869预处理后的OCI/AML3细胞与CD8+T细胞共培养，CFSE实验检测CD8+T细胞增殖能力，ELISA实验检测CD8+T细胞IL-2和IFN-γ的释放量，细胞流式分析技术检测CD8+T细胞CD25和GranzymeB的表达量；将梯度密度离心法去除sEVs后的OCI/AML3培养上清（OCI/AML3-CM）培养CD8+T细胞，CFSE实验检测CD8+T细胞增殖能力，ELISA实验检测CD8+T细胞IL-2和IFN-γ的释放量，细胞流式分析技术检测CD8+T细胞CD25和GranzymeB的表达量；梯度密度离心法提取白血病细胞sEVs外泌体（NB4-sEVs、OCI/AML2-sEVs和OCI/AML3-sEVs），纳米颗粒跟踪技术（NTA）分析其大小，透射电镜（TEM）分析其形态，WesternBlot检测sEVs特异性蛋白表达量；将白血病细胞来源的sEVs与CD8+T细胞共培养，CFSE实验检测CD8+T细胞增殖能力，ELISA实验检测CD8+T细胞IL-2和IFN-γ的释放量，细胞流式分析技术检测CD8+T细胞CD25和GranzymeB的表达量。（3）将白血病细胞来源的sEVs与CD8+T细胞共培养，肌酸检测试剂盒检测CD8+T细胞胞内和胞外肌酸含量，ATP检测试剂盒检测CD8+T细胞胞内ATP含量，qRT-PCR检测CD8+T细胞中肌酸代谢关键酶的RNA水平，WesternBlot检测CD8+T细胞中肌酸代谢关键酶的蛋白水平；用siRNA技术敲低CD8+T细胞内SLC6A8表达量，WesternBlot检测CD8+T细胞SLC6A8表达量，肌酸检测试剂盒检测CD8+T细胞胞内肌酸含量，ATP检测试剂盒检测CD8+T细胞胞内ATP含量，CFSE实验检测CD8+T细胞增殖能力，ELISA实验检测CD8+T细胞IL-2和IFN-γ的释放量，细胞流式分析技术检测CD8+T细胞CD25和GranzymeB的表达量；在OCI/AML3-sEVs与CD8+T细胞共培养体系中，在CD8+T细胞中转入SLC6A8过表达质粒，WesternBlot检测CD8+T细胞SLC6A8表达量，WesternBlot检测CD8+T细胞SLC6A8表达量，肌酸检测试剂盒检测CD8+T细胞胞内肌酸含量，ATP检测试剂盒检测CD8+T细胞胞内ATP含量，CFSE实验检测CD8+T细胞增殖能力，ELISA实验检测CD8+T细胞IL-2和IFN-γ的释放量，细胞流式分析技术检测CD8+T细胞CD25和GranzymeB的表达量。（4）采用生物信息学分析NPM1突变白血病中的差异miRNAs与调控SLC6A8的miRNAs，qRT-PCR检测白血病sEVs中的靶miRNAs表达量；将转入Cy3标记的靶miRNA的OCI/AML3细胞与CD8+T细胞共培养，免疫荧光法分析CD8+T细胞中红色荧光的表达量；双荧光素酶实验检测靶miRNA与SLC6A8启动子的结合作用；采用mimic在CD8+T细胞中过表达靶miRNA，qRT-PCR检测CD8+T细胞中的靶miRNAs表达量，WesternBlot检测CD8+T细胞SLC6A8表达量，肌酸检测试剂盒检测CD8+T细胞胞内肌酸含量，ATP检测试剂盒检测CD8+T细胞胞内ATP含量，CFSE实验检测CD8+T细胞增殖能力，ELISA实验检测CD8+T细胞IL-2和IFN-γ的释放量，细胞流式分析技术检测CD8+T细胞CD25和GranzymeB的表达量；采用shRNA技术敲低OCI/AML3-sEVs中的靶miRNA,qRT-PCR检测OCI/AML3细胞和OCI/AML3-sEVs中的靶miRNA表达量；将敲低靶miRNA的OCI/AML3-sEVs与CD8+T细胞共培养，WesternBlot检测CD8+T细胞SLC6A8表达量，CFSE实验检测CD8+T细胞增殖能力，ELISA实验检测CD8+T细胞IL-2和IFN-γ的释放量，细胞流式分析技术检测CD8+T细胞CD25和GranzymeB的表达量。（5）qRT-PCR检测白血病细胞（NB4、THP1、KG-1a、OCI/AML2、OCI/AML3）以及白血病细胞来源的sEVs中靶miRNA的表达量；采用shRNA敲低OCI/AML3细胞中NPM1，WesternBlot检测OCI/AML3细胞中NPM1和NPM1突变蛋白（NPM1mA）的表达量，qRT-PCR检测OCI/AML3细胞以及OCI/AML3-sEVs中靶miRNA的表达量；采用生物信息学分析靶miRNA的宿主基因；采用荧光素酶报告实验和ChIP检测NPM1突变蛋白与靶miRNA的宿主基因启动子的结合作用；采用生物信息学对靶miRNA的RNA结合蛋白以及RNA结合蛋白在基因组的位置进行分析；采用RIP和pulldown实验检测靶miRNA与RNA结合蛋白的结合作用。（6）采用人源化NSG小鼠建立白血病模型，经尾静脉分别注射OCI/AML3、OCI/AML3NC、OCI/AML3miRNAKD和OCI/AML3-miRNAKD+sEVs，生存曲线分析小鼠的整体生存情况，流式细胞分析小鼠骨髓液中CD45+细胞含量，采用瑞氏染色检测骨髓液中白血病细胞含量，采用Hamp;E染色和免疫荧光检测肝脏和脾脏中白血病细胞含量，免疫荧光检测骨髓液中CD8+T细胞含量，CFSE实验检测CD8+T细胞增殖能力，ELISA实验检测CD8+T细胞IL-2和IFN-γ的释放量，WesternBlot检测CD8+T细胞中SLC6A8的表达量，ELISA检测CD8+T细胞中肌酸含量。<br>　　结果：（1）与良性血液疾病患者以及NPM1非突变型AML患者相比，NPM1突变型AML患者骨髓液中CD8+T细胞的含量、增殖能力、IL-2和IFN-γ的释放量明显较低；在共培养体系中发现与良性血液疾病患者以及NPM1非突变型AML患者相比，NPM1突变型AML患者的血清能够显著抑制CD8+T细胞的免疫功能；与NPM1非突变型AML细胞相比（NB4和OCI/AML2），NPM1突变型AML细胞OCI/AML3的培养上清（OCI/AML3-CM）可抑制CD8+T细胞的免疫功能。（2）密度梯度离心去除OCI/AML3-CM中的sEVs以及GW4869抑制sEVs的释放均可在一定程度上去除OCI/AML3-CM中的sEVs；sEVs的去除减弱了OCI/AML3-CM对CD8+T细胞免疫功能的抑制作用；成功提取并且验证了NB4-sEVs、OCI/AML2-sEVs和OCI/AML3-sEVs；OCI/AML3-sEVs显著抑制CD8+T细胞免疫功能。（3）与NB4-sEVs和OCI/AML2-sEVs相比，OCI/AML3-sEVs明显降低CD8+T细胞内的肌酸和ATP的含量，增加培养基中肌酸的含量，抑制肌酸转运体SLC6A8的表达；敲低CD8+T细胞中的SLC6A8显著降低CD8+T细胞中的肌酸代谢以及免疫功能；在OCI/AML3-sEVs与CD8+T细胞共培养体系中，过表达CD8+T细胞中SLC6A8水平能明显回复CD8+T细胞肌酸代谢水平以及免疫功能。（4）筛选并验证得到sEVs中的miR-19a-3p可能调控CD8+T细胞肌酸代谢以及免疫功能;CD8+T细胞中miR-19a-3p可直接调控SLC6A8的表达量；过表达CD8+T细胞中的miR-19a-3p可抑制CD8+T细胞中SLC6A8的表达量、抑制肌酸代谢、抑制其免疫功能；敲低sEVs的miR-19a-3p，可抑制sEVs对CD8+T细胞的抑制作用；临床样本中血清sEVs中的miR-19a-3p在NPM1突变患者中高表达，且其表达量与CD8+T细胞肌酸代谢和免疫功能呈负相关。（5）miR-19a-3p在NPM1突变白血病细胞及其sEVs中异常高表达；敲低OCI/AML3细胞中NPM1可抑制sEVs中miR-19a-3p的表达量；生物信息学分析揭示miR-19a-3p位于宿主基因MIR17HG中，且CTCF可能参与其调控；NPM1突变蛋白可抑制CTCF出核；CTCF可与MIR17HG启动子结合并参与其转录调控；生物信息学分析揭示PABPC1是miR-19a-3p的一个重要RNA结合蛋白，以及PABPC1启动子上H3K27ac丰度较高；PABPC1和miR-19a-3p可直接结合，且促进miR-19a-3p包裹到sEVs中；NPM1突变蛋白可调控PABPC1启动子上的H3K27ac以及PABPC1表达。（6）利用人源化NSG小鼠白血病模型揭示了miR-19a-3p抑制CD8+T细胞中SLC6A8的表达、免疫功能，并促进白血病的免疫逃逸。<br>　　结论：（1）NPM1突变白血病细胞可抑制CD8+T细胞免疫功能。（2）NPM1突变白血病细胞通过sEVs释放抑制CD8+T细胞免疫功能。<br>　　（3）NPM1突变白血病源性sEVs通过下调CD8+T细胞中SLC6A8介导的肌酸代谢从而抑制其免疫功能。（4）NPM1突变白血病源性sEVs转运miR-19a-3p至CD8+T细胞抑制SLC6A8的表达。（5）NPM1突变蛋白一方面抑制CTCF出核，阻碍了CTCF对miR-19a-3p宿主基因MIR17HG的转录抑制作用，进而促进miR-19a-3p的表达；另一方面通过H3K27ac促进miR-19a-3p结合蛋白PABPC1的表达，进而促使miR-19a-3p包裹至sEVs。（6）白血病源性sEVs传递miR-19a-3p抑制CD8+T细胞功能促进NPM1突变白血病发生免疫逃逸。