二氧化铈纳米颗粒孕期暴露对胎盘早期发育的影响及机制研究-论文-万方医学网

二氧化铈纳米颗粒孕期暴露对胎盘早期发育的影响及机制研究

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摘要目的：纳米材料因其优异的物理化学性能在生产生活中得到广泛应用，这使人们接触到纳米材料的机会大大增加。纳米稀土材料可以兼容活细胞和蛋白，与传统纳米材料相比，具有更高载药量、更易穿透血管、不易受酶的降解且在局部组织有较高聚集浓度等特点。二氧化铈纳米颗粒（CeO2NPs）作为新型纳米稀土材料，虽已被广泛用于功能陶瓷、紫外线吸收剂、化妆品添加剂和食品抗氧化剂等多个领域，在肿瘤靶向治疗方面亦展现出良好的应用价值，但其生物安全性仍存在争议。 　　妊娠期雌性个体的机能发生变化，对环境因素敏感性显著增加，因此纳米颗粒孕期暴露对妊娠的影响值得高度重视。作为生物医药领域备受关注的新型材料，CeO2NPs对妊娠及胎盘早期发育的生物效应仍不明确，妊娠早期CeO2NPs暴露是否会通过影响胎盘的正常发育而造成妊娠损害不得而知。特别是胎盘早期发育过程中，蜕膜细胞可分泌多种细胞因子调控滋养细胞的侵袭，蜕膜细胞来源的外泌体也可介导这一调控过程。因此，CeO2NPs孕期暴露是否通过改变蜕膜细胞来源的外泌体基因表达而影响滋养细胞侵袭从而损害早期胎盘发育值得深入研究。 　　本研究拟合成CeO2NPs，构建小鼠孕早期CeO2NPs暴露模型，揭示CeO2NPs孕期暴露对早期胎盘发育及妊娠的生物效应，并从蜕膜细胞来源外泌体介导滋养细胞功能进而影响胎盘发育的角度揭示CeO2NPs孕期暴露对胎盘发育产生生物负效应的分子机制，探寻有效防治CeO2NPs孕期暴露的生物负效应作用靶点，补充CeO2NPs的生物安全性研究，为促进CeO2NPs的规范应用提供实验依据。 　　方法： 　　1.CeO2NPs孕期暴露对小鼠胎盘早期发育及妊娠的影响研究 　　（1）CeO2NPs的合成与表征：根据参考文献用微乳液法制备CeO2NPs并用场发射透射电镜表征其晶格参数，同时用能量色散谱表征Ce元素和O元素，以证明CeO2NPs的合成成功。 　　（2）CeO2NPs孕期暴露小鼠模型构建：参考CeO2NPs靶向药物治疗肿瘤处理剂量，我们设定了5种不同的CeO2NPs小鼠体内暴露剂量（2.5mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、7.5mg/kg、10mg/kg）。选用BALB/C小鼠，雄雌鼠合笼后，以查见阴道栓记为孕1天（D1），于D5、D6、D7（蜕膜化时期）尾静脉注射CeO2NPs溶液分别建立不同剂量的孕期暴露小鼠模型，用相同体积蒸馏水尾静脉注射组作为对照，并于D8，D9，D10和D12采集小鼠血清以及小鼠心、肝、肺、肾、卵巢和子宫等组织。通过观察不同浓度CeO2NPs孕期暴露后孕鼠的子宫外观形态以及心、肝、肺、肾、卵巢状态，筛选CeO2NPs孕期暴露的安全参考剂量范围。 　　（3）宫腔内组织中CeO2NPs分布检测及妊娠结局观察：利用ICP-MS检测宫腔内组织中纳米颗粒的分布情况。通过繁殖试验，观察CeO2NPs孕期暴露后的小鼠妊娠结局，包括产仔数量、胎鼠外观及重量。 　　（4）胎盘形态结构观察：观察胎盘发育早期关键时段—即孕期D8（蜕膜化结束）、D9（螺旋动脉重塑）、D10（胎盘循环建立）、D12（胎盘结构形成）的宫腔内妊娠情况，Hamp;E染色观察蜕膜和胎盘组织结构变化。 　　（5）胎盘功能检测：ELISA测定小鼠血清中胎盘分泌的血清绒毛膜促性腺激素β-CG水平。 　　（6）胎盘发育相关指标检测：利用RT-PCR检测胎盘组织中Hand1、Mash2、GCM1、PLGF的表达水平,以评价胎盘发育状态；RT-PCR检测胎盘血管生成相关基因（Ang1、Ang2、Ang4、Corin、Vegfa）表达；DBA荧光显色以标记uNK细胞数目；RT-PCR检测uNK细胞募集分化相关基因（IL-15）表达、颗粒酶编码相关基因（Klrg1、Prf1）表达，以评价胎盘血管重塑情况。 　　（7）胎盘滋养细胞侵袭相关指标检测：Hamp;E染色观察调控小鼠胎盘滋养细胞侵袭的关键时期蜕膜组织形态；RT-PCR检测该时期蜕膜组织中调控滋养细胞侵袭相关基因（Igfbp4、Ptgs2）的mRNA水平；IHC检测该时期蜕膜组织中滋养细胞侵袭调控相关蛋白（COX-2）的表达；IHC检测小鼠胎盘组织中CK8（外胎盘锥标志物）、PRL3D1（滋养巨细胞标志物）的表达水平，以评价胎盘滋养细胞侵袭状态。 　　2.CeO2NPs孕期暴露影响胎盘早期发育的机制研究 　　（1）建立子宫内膜基质细胞的CeO2NPs暴露模型：分离小鼠原代子宫内膜基质细胞，免疫荧光检测基质细胞标志物Vimentin的表达以鉴定细胞纯度；采用不同浓度CeO2NPs（1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml）处理体外培养的基质细胞，CCK8检测各个浓度CeO2NPs暴露对基质细胞的细胞活力的影响。 　　（2）CeO2NPs暴露对小鼠子宫内膜基质细胞蜕膜化的影响研究：通过雌孕激素构建体外诱导基质细胞蜕膜化模型，以不加雌孕激素处理的基质细胞为对照组，雌孕激素处理的细胞为诱导组（E2P4组），激素诱导的同时加入对细胞活力无显著影响浓度的CeO2NPs为CeO2NPs暴露组（E2P4+CeO2NPs联合暴露组），利用RT-PCR检测各组细胞中蜕膜标志分子Dtprp的表达水平。 　　（3）CeO2NPs暴露通过影响蜕膜组织分泌干扰滋养细胞侵袭的分子机制研究： 　　①蜕膜来源外泌体的提取及鉴定：采用外泌体提取试剂盒分离各组小鼠蜕膜细胞培养基中的外泌体，利用透射电镜观察外泌体形态、纳米流式检测仪检测外泌体粒径及颗粒浓度，对外泌体进行鉴定。 　　②CeO2NPs暴露对蜕膜来源外泌体miRNAs表达的影响：对各组蜕膜细胞来源的外泌体进行miRNAs测序及生物信息学分析，筛选CeO2NPs暴露组与诱导组之间差异表达的miRNAs，并利用RT-PCR对差异表达的miRNAs在各组蜕膜细胞中的表达进行检测，筛选CeO2NPs暴露导致蜕膜来源外泌体中表达出现显著变化的关键miRNA。 　　③CeO2NPs暴露通过蜕膜来源外泌体miRNAs干扰滋养细胞侵袭的分子机制研究：建立外泌体-滋养细胞互作模型（用PKH67染料标记蜕膜来源的外泌体，再与滋养细胞共培养24h）；免疫荧光观察滋养细胞对蜕膜细胞来源外泌体的摄取，利用筛选出的差异表达miRNA的模拟物或抑制物处理滋养细胞；RT-PCR检测滋养细胞中miRNA的表达；划痕实验检测滋养细胞的迁移能力变化；Transwell实验检测滋养细胞的侵袭能力变化；利用华大基因Dr.Tom系统预测差异表达miRNAs的潜在靶基因；采用miRNA的模拟物或抑制物处理滋养细胞后，WesternBlot检测预测靶基因的蛋白表达。 　　结果： 　　1.CeO2NPs孕期暴露对小鼠胎盘早期发育及妊娠的影响研究 　　（1）通过场发射透射电镜观察发现CeO2NPs尺寸为3-5nm，晶格形态与文献报道一致，能量色散谱结果显示出Ce元素和O元素特征峰，证明CeO2NPs的合成成功。 　　（2）通过观察D8、D9、D10、D12孕鼠子宫外观发现，CeO2NPs孕期暴露的致死剂量可能为10mg/kg，5mg/kgCeO2NPs及以上剂量孕期暴露均可产生明显的不良妊娠结局，孕鼠子宫从D9开始出现胚胎拥挤，D12出现子宫出血与胚胎发育不均衡，故以5mg/kgCeO2NPs孕期暴露小鼠模型进行后续实验。繁殖实验表明CeO2NPs暴露组的幼仔数量更少，体重更轻，且出现生长受限。CeO2NPs暴露组D8、D9、D10和D12孕鼠的体重和子宫重量无明显差异，但D12孕鼠的胚胎吸收率更高。 　　（3）ICP-MS实验证实CeO2NPs暴露孕鼠的蜕膜或胎盘组织中CeO2NPs含量从D8开始蓄积，D9达峰值，D10开始逐渐减少。 　　（4）Hamp;E染色显示CeO2NPs暴露在D12妊娠小鼠心脏、肝脏、肺、肾脏和卵巢组织中未见明显异常病理变化。 　　（5）体式显微镜观察发现CeO2NPs暴露后在D12的胎鼠中出现生长受限及出血，胎盘尺寸重量减小；Hamp;E染色显示CeO2NPs暴露孕鼠D12胎盘蜕膜层出血，海绵滋养层面积明显增加而迷路层的面积明显减少，D10孕鼠胎盘蜕膜区出现异常增大的血窦和出血；ELISA检测证实CeO2NPs暴露孕鼠在D12血清β-CG含量显著降低，以上结果提示CeO2NPs孕期暴露导致小鼠早期发育的胎盘结构和功能明显受损。 　　（6）通过RT-PCR发现，CeO2NPs暴露组D10胎盘发育相关基因（Hand1、Mash2、GCM1、PLGF）的表达较对照组下调，胎盘血管生成相关基因（Vegfa、Ang1、Ang2、Ang4和Corin）表达下调；DBA染色显示uNK细胞在CeO2NPs暴露组D8数量无明显变化，D9阳性细胞数量明显减少；RT-PCR发现，CeO2NPs暴露组D8蜕膜组织中颗粒酶编码相关基因Prf1表达下降，D9蜕膜组织中uNK细胞募集分化相关基因IL-15和颗粒酶编码相关基因Prf1、Klrg1的表达均显著减少。以上结果表明CeO2NPs孕期暴露导致小鼠胎盘发育异常。 　　（7）Hamp;E染色显示CeO2NPs暴露组D8子宫蜕膜组织形态无明显变化，D9子宫蜕膜区域出现异常增大的血窦；RT-PCR发现蜕膜组织中促进滋养细胞侵袭相关基因Igfbp4的mRNA水平较对照组增加，而促进滋养细胞侵袭相关基因Ptgs2的mRNA水平较对照组降低；IHC发现CeO2NPs暴露孕鼠蜕膜组织中滋养细胞侵袭调控相关蛋白COX-2的表达显著下降；IHC发现CK8（外胎盘锥标志物）在CeO2NPs暴露组小鼠D8、D9胎盘组织中的表达下降，PRL3D1（滋养巨细胞标志物）在CeO2NPs暴露组小鼠D10胎盘组织中的表达增加。以上结果表明CeO2NPs孕期暴露导致胎盘滋养细胞侵袭异常。 　　2.CeO2NPs孕期暴露影响胎盘早期发育的机制研究 　　（1）通过免疫荧光染色发现，体外分离的小鼠子宫内膜基质细胞呈Vimentin阳性，证实小鼠子宫内膜基质细胞分离成功；CCK8结果发现，终浓度为1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml的CeO2NPs暴露对小鼠子宫内膜基质细胞活力均无明显影响，在对小鼠子宫内膜基质细胞活力无影响的情况下，选用16μg/ml的CeO2NPs进行后续所有细胞实验。 　　（2）通过RT-PCR发现，蜕膜化标志分子Dtprp在E2P4组和E2P4+CeO2NPs联合暴露组细胞中的表达均较对照组明显上调，但E2P4组细胞和E2P4+CeO2NPs联合暴露组细胞中Dtprp的表达无明显差异。 　　（3）透射电镜观察发现，各组外泌体具有明显茶托状或一侧凹陷的半球状脂质双层膜经典外泌体结构，平均粒径在30-150nm之间，提示外泌体提取成功。 　　（4）对蜕膜细胞来源的外泌体小RNA进行测序，结果发现CeO2NPs暴露组有85个miRNAs表达较对照组发生显著变化，其中53个表达上调，32个表达下调；生物信息学分析结果显示，在外泌体中表达量较高且差异显著的10个miRNAs（miR-133a-3p、miR-1a-3p、miR-22-3p、miR-451a、miR-26a-5p、miR-99a-5p、miR-126a-3p、miR-196b-5p、miR-100-5p、miR-146b-5p）有169个预测的潜在靶基因，显著富集于类固醇生物合成通路、精氨酸和脯氨酸代谢通路、PI3K-Akt信号通路、细胞凋亡通路、心肌细胞中的肾上腺素能信号通路、抗生素生物合成通路以及刺猬信号通路；经RT-PCR验证miR-99a-5p在CeO2NPs暴露蜕膜细胞中的表达显著上调，与测序结果一致。 　　（5）PKH67染料标记的外泌体与HTR-8/SVneo共培养24h后，可见PKH67荧光分布于HTR-8/Svneo细胞核周围的细胞质中；分别以miR-99a-5p的mimics或inhibitors处理HTR-8/SVneo，RT-PCR结果显示，miR-99a-5p在mimics处理组细胞中的表达显著增加，而在inhibitors处理组细胞中的表达显著减少；划痕实验结果显示，过表达或下调miR-99a-5p后的滋养细胞在6h、12h、24h的划痕愈合率较对照组无显著差异；Transwell实验结果显示，过表达miR-99a-5p组穿过小室的细胞数目显著减少，而下调miR-99a-5p组穿过小室的细胞数目显著增加；通过华大基因Dr.Tom系统预测得到miR-99a-5p的潜在靶基因Ckb，WesternBlot结果显示Ckb在过表达miR-99a-5p组的蛋白表达水平显著下降，而在干扰miR-99a-5p组的蛋白表达显著上调。以上结果提示Ckb可能是miR-99a-5p的潜在靶基因。 　　结论：本研究利用动物模型和细胞模型揭示了CeO2NPs孕期暴露影响小鼠早期胎盘发育和妊娠的生物学效应及其作用机制，得到以下结论。 　　1.超过一定剂量的CeO2NPs暴露（5mg/kg）可导致小鼠早期胎盘发育异常，进而导致不良妊娠结局。 　　2.CeO2NPs孕期暴露可导致胎盘滋养细胞分化侵袭功能异常和胎盘血管重塑障碍。蜕膜细胞分泌功能的变化与uNK细胞的募集分化失常可能是CeO2NPs暴露损害胎盘发育的重要机制。 　　3.CeO2NPs孕期暴露可改变蜕膜来源外泌体中多个miRNAs的表达，这些差异表达的miRNAs涉及类固醇生物合成通路、PI3K-Akt信号通路、细胞凋亡通路等，蜕膜来源的外泌体可能参与介导CeO2NPs暴露影响胎盘滋养细胞功能的过程。 　　4.蜕膜来源外泌体中的miR-99a-5p参与调控滋养细胞侵袭，CeO2NPs暴露可通过促进蜕膜来源外泌体中miR-99a-5p的表达，抑制滋养细胞的侵袭，而Ckb可能是miR-99a-5p抑制滋养细胞侵袭的潜在靶基因。