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摘要目的：<br>　　二氧化铈纳米颗粒(CeO2NPs)是重要的纳米稀土氧化物，兼具纳米材料和稀土的特性，在生物医药领域备受青睐的同时，对人体健康的影响也引起人们的广泛关注。课题组前期研究发现小鼠孕期暴露于一定剂量的CeO2NPs可通过影响滋养细胞侵袭损害胎盘发育，但相关机制不明。已有研究证实，部分纳米颗粒被细胞内化后可刺激细胞发生应激反应，触发细胞过度自噬进而产生生物效应。因此，自噬在CeO2NPs孕期暴露导致滋养细胞功能异常的过程中是否发挥重要作用值得深入研究。本研究通过构建小鼠和滋养细胞CeO2NPs暴露模型，旨在深入探讨CeO2NPs孕期暴露对滋养细胞侵袭和胎盘早期发育的损伤机制，明确自噬在CeO2NPs暴露影响滋养细胞功能中的作用，补充CeO2NPs的生物安全性研究，为CeO2NPs的应用和生物负效应防治提供实验依据。<br>　　方法：<br>　　1.CeO2NPs合成和表征：采用微乳液法制备CeO2NPs；应用场发射透射电子显微镜（FE-TEM）测定CeO2NPs的尺寸和形貌。<br>　　2.CeO2NPs孕期暴露小鼠模型构建：构建不同剂量CeO2NPs的BALB/c小鼠孕期暴露模型，以查见阴栓记为妊娠第1天（GD1），后续孕天数以此类推。在GD5、GD6、GD7尾静脉注射2.5、4、5、7.5和10mg·kg-1·d-1剂量的CeO2NPs，同时设立空白对照组和溶剂对照组，分别于GD8、GD9、GD10、GD12收集组织。<br>　　3.CeO2NPs暴露对小鼠妊娠状态及胎盘发育的影响研究：采集并观察孕鼠GD8、GD9、GD10、GD12的子宫外观，GD10的胚胎外观和GD12的胎盘外观变化；Hamp;E染色观察组织病理形态变化；透射电镜（TEM）观察CeO2NPs在胎盘组织的沉积；Hamp;E染色观察早期发育关键时期胎盘的形态变化；免疫荧光检测GD12胎盘滋养层细胞的特异性指标。<br>　　4.CeO2NPs暴露对胎盘滋养细胞自噬的影响研究：TEM观察CeO2NPs暴露后胎盘滋养细胞中的自噬情况；免疫荧光检测胎盘滋养细胞中LC3的表达水平；WesternBlot检测自噬标志性蛋白LC3II/LC3I、Beclin1和P62的表达变化。<br>　　5.CeO2NPs暴露对人绒毛膜滋养细胞（HTR-8/SVneo）功能的影响研究：用0、4、8、16、32和64μg·ml-1CeO2NPs处理HTR-8/SVneo细胞24h，以0μg·ml-1为空白对照组，TEM观察CeO2NPs在HTR-8/SVneo细胞中的沉积和细胞超微结构变化；利用细胞划痕实验和Transwell实验评估CeO2NPs暴露对滋养细胞迁移和侵袭的影响。<br>　　6.CeO2NPs暴露对HTR-8/SVneo细胞自噬的影响及机制研究：TEM观察CeO2NPs暴露后HTR-8/SVneo细胞中自噬的情况；免疫荧光检测CeO2NPs暴露后HTR-8/SVneo细胞自噬标志性蛋白LC3的表达水平；WesternBlot检测自噬标志性蛋白LC3II/LC3I、Atg5、Beclin1、P62的表达水平及其上游调控因子Raptor、mTOR蛋白的表达，以及mTOR经典信号通路相关蛋白的表达；利用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）或氯喹（CQ）干扰自噬过程，通过细胞划痕和Transwell实验检测在抑制自噬启动或阻断自噬通量的情况下CeO2NPs暴露对滋养细胞迁移和侵袭的影响。<br>　　7.CeO2NPs暴露对滋养细胞线粒体自噬的影响研究：线粒体超氧化物荧光探针（MitoSOX）检测HTR-8/SVneo细胞线粒体超氧化物水平；免疫荧光检测细胞线粒体自噬标志分子的表达；WesternBlot检测线粒体自噬相关蛋白Phb2、PINK1和Parkin的表达情况。<br>　　结果：<br>　　1.FE-TEM测试结果发现制备的纳米颗粒粒径为3-5nm，且呈晶格形式，表明CeO2NPs合成成功。<br>　　2.不同剂量的CeO2NPs（2.5、4、5、7.5和10mg·kg-1·d-1）小鼠孕期暴露，实验发现10mg·kg-1·d-1CeO2NPs可导致孕鼠死亡，提示10mg·kg-1·d-1为孕鼠致死剂量，后续体内实验采用的最高剂量为7.5mg·kg-1·d-1。<br>　　3.TEM可观察到5和7.5mg·kg-1·d-1剂量组胎盘滋养细胞中有CeO2NPs的沉积。剖析GD10和GD12的小鼠子宫发现，在GD10CeO2NPs暴露组中可见局部的胚胎表面出血，而在GD12CeO2NPs暴露组中子宫出血严重并伴有胚胎重吸收。进一步研究发现CeO2NPs暴露使胎盘迷路层结构异常，面积显著减少，并且导致迷路层母体血管重塑异常。以上结果表明妊娠期CeO2NPs暴露导致胎盘早期发育异常。<br>　　4.TEM检测发现CeO2NPs暴露后胎盘滋养层中自噬体和溶酶体的数量明显增加。TPBPA和LC3免疫荧光共定位结果验证了CeO2NPs暴露后小鼠胎盘海绵滋养层中的LC3荧光信号明显增强。WesternBlot检测表明孕12天胎盘组织中自噬关键基因LC3II/LC3I、Beclin1和P62的表达水平升高。这些结果提示CeO2NPs暴露诱导小鼠胎盘滋养细胞自噬激活。<br>　　5.TEM观察发现CeO2NPs可被HTR-8/SVneo细胞摄取并在胞质中沉积。细胞划痕实验结果表明，CeO2NPs暴露后HTR-8/SVneo细胞的愈合率显著降低。Transwell实验结果显示一定浓度的CeO2NPs暴露导致穿过小室的细胞数目减少。这些结果表明CeO2NPs暴露抑制HTR-8/SVneo细胞的迁移和侵袭能力。<br>　　6.TEM检测发现CeO2NPs暴露后HTR-8/SVneo细胞中自噬体、溶酶体和自噬溶酶体增多。免疫荧光结果显示，在CeO2NPs组可观察到明显的LC3信号。WesternBlot检测证实自噬关键基因LC3-Ⅱ/Ⅰ、Atg5和Beclin1表达水平升高，P62、p-Raptor和p-mTOR表达水平降低。CeO2NPs暴露后AMPK/mTOR和PI3K/AKT/mTOR经典信号通路中相关蛋白的表达无明显变化。我们进一步利用自噬抑制剂3-MA抑制自噬启动，结果发现CeO2NPs与3-MA联合处理后，HTR-8/SVneo细胞愈合率有所升高，穿过小室的细胞数量有所增加。利用自噬抑制剂CQ阻断自噬通量，结果发现CeO2NPs与CQ联合处理后，细胞愈合率进一步降低，穿过小室的细胞数量进一步减少。以上结果表明CeO2NPs暴露通过激活细胞自噬抑制HTR-8/SVneo细胞的迁移和侵袭能力。<br>　　7.MitoSOX检测结果发现CeO2NPs暴露后HTR-8/SVneo细胞MitoSOX荧光减少。免疫荧光结果显示TOM20与LC3荧光信号未发生重叠。WesternBlot结果发现，CeO2NPs暴露后线粒体自噬关键蛋白Phb2、PINK1和Parkin的表达没有明显变化。提示CeO2NPs暴露不影响HTR-8/SVneo细胞的线粒体自噬。<br>　　结论：本研究通过动物模型和细胞模型，揭示了CeO2NPs孕期暴露对滋养细胞功能和胎盘发育的影响，并从自噬的角度阐明CeO2NPs影响滋养细胞功能的分子机制，补充了CeO2NPs的生物安全性，为防控妊娠期暴露CeO2NPs的生物学负效应提供了实验依据。体内实验结果表明妊娠期暴露于CeO2NPs可通过自噬功能障碍导致胎盘发育异常进而对小鼠妊娠状态产生不利影响。体外实验结果表明暴露于CeO2NPs可能通过mTORC1信号通路过度诱导自噬抑制滋养细胞功能。综上所述，CeO2NPs暴露可能通过mTORC1信号通路介导的过度自噬激活导致滋养细胞功能障碍，进而损害胎盘发育，最终导致不良妊娠结局。