检索历史 清除

摘要研究背景<br>　　精准医疗是现在医学发展的趋势，实现对肿瘤精准诊断和分类是精准医疗发展的重要目标之一。核酸适配体以其本身高亲和性、免疫原性弱、设计灵活等优点在肿瘤诊断、成像、治疗、药物靶向运输上已有广泛的应用。滚环扩增反应是一种恒温核酸扩增反应，扩增产物可以实现靶核酸的信号放大。基于适配体的靶向识别作用结合滚环扩增反应的信号放大模式可以灵敏的检测肿瘤细胞，为临床简单快速检测血液循环肿瘤细胞提供新思路。<br>　　目的<br>　　基于核酸适配体互补链触发的滚环扩增反应用于肿瘤细胞检测，通过特异性的荧光信号提高对肿瘤细胞检测的特异性和敏感度。<br>　　方法<br>　　1.适配体（AptS2.2）、FAM标记的适配体（FAM-AptS2.2）、互补链(cDNA)、锁式探针(Padlock)用结合缓冲液稀释为贮存母液，分装保存。<br>　　2.激光扫描共聚焦显微镜验证FAM-AptS2.2结合靶细胞MCF-7细胞。<br>　　3.AptS2.2和cDNA各取相同体积加入结合缓冲液稀释为工作液，混匀后95℃反应5min缓慢降至室温，形成互补双链。<br>　　4.通过加入靶细胞，诱导双链解链，cDNA作为Padlock的引物，在T4DNA连接酶作用下，锁式探针连接成环状DNA。<br>　　5.Phi29DNA聚合酶催化互补链以环状DNA为模板触发滚环扩增反应(RCA)，形成串联重复的单链DNA。通过对Padlock进行设计，使滚环扩增的产物为串联重复的G-四链体结构。<br>　　6.实验流程的构建分析，包括非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)和琼脂糖凝胶电泳验证实验构建过程，紫外可见吸收光谱分析RCA产物。<br>　　7.荧光信号输出检测，扩增产物G-四链体结构敏化铽离子（Tb3+）发光，使得靶细胞的数量信号转化为放大的Tb3+荧光信号。<br>　　8.条件优化，通过对靶细胞与AptS2.2-cDNA孵育时间，RCA时间及Tb3+浓度进行调整，得到本方法检测的最佳性能。<br>　　9.通过测定不同浓度靶细胞得到的扩增产物的Tb3+荧光强度分析该方法的最低检测限和线性范围。<br>　　10.使用相同最佳条件用于靶细胞和阴性对照细胞的检测，用于判断该方法的灵敏性和特异性。<br>　　结果<br>　　1.激光扫描共聚焦显微镜验证FAM-AptS2.2结合靶细胞。<br>　　2.Native-PAGE和琼脂糖凝胶电泳验证了实验的构建过程和RCA产物的形成。<br>　　3.紫外分光光谱验证了RCA产物为G-四链体结构。<br>　　4.实验的最佳工作条件为：靶细胞与cDNA在37℃条件下孵育1h,后续RCA的时间为40min，在0.25μM的Tb3+浓度下，拥有最佳的分析性能。<br>　　5.该方法用于靶细胞MCF-7的检测范围为102-105个/mL，最低检测限为8个/mL。<br>　　6.以正常组织细胞HEK-293T细胞，肿瘤对照细胞HepG2细胞与HeLa细胞与靶细胞MCF-7细胞进行荧光强度对比，非靶细胞的相对荧光强度远远低于靶细胞。<br>　　结论<br>　　本课题建立的检测肿瘤细胞的方法具有良好的特异性和灵敏度，操作简单，通过更换相应Apt及cDNA、Padlock可广泛用于各类靶标的检测，具有良好的运用前景。