摘要目的:<br> 为了探寻党参质量标志物(Q-marker),更加客观地评价党参质量,采用高效液相色谱法(HPLC)测定和分析党参中的小分子成分含量,采用分散液相微萃取—高效液相色谱法(DLPME-HPLC)富集和测定党参中的党参炔苷和苍术内酯Ⅲ,寻找不同基原、不同规格党参的化学差异标志物;应用中空纤维细胞捕获—高效液相色谱法(HFCF-HPLC)初步筛选党参中的抗炎活性成分,探索党参潜在的生物活性标志物。本文为寻找党参Q-marker,完善党参质量评价体系提供依据。<br> 方法:<br> 1.在本课题组前期研究基础上,采用HPLC测定了45批不同基原、不同规格党参药材中的4个指标性成分—紫丁香苷、党参苷Ⅰ、党参炔苷、苍术内酯Ⅲ的含量。应用单因素方差分析(one-wayANOVA)、系统聚类分析(HCA)、主成分分析(PCA)以及正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)等方法对不同基原、不同规格党参药材进行比较和质量评价。<br> 2.应用DLPME-HPLC对党参中的党参炔苷和苍术内酯Ⅲ进行富集和测定,以甲基三辛基氯化铵(TOMAC)和正丁醇所制备的低共熔溶剂(DES)作为萃取剂,采用单因素设计对萃取条件进行了优化,在最佳条件下进行了方法学考察,对不同基原的17批党参药材中的两个目标分析物进行含量测定和单因素方差分析。将该方法与已发表方法进行比较,说明DLPME-HPLC在党参质量评价中的可行性及优势。<br> 3.在初步明确党参甲醇提取物具有抗炎活性的基础上,将种植有RAW264.7细胞的中空纤维作为活性筛选的工具,置于党参甲醇提取液中,对党参中的抗炎活性成分进行初步筛选和捕获,结合高效液相色谱法(HPLC-UV)对成分进行鉴定,初步筛选党参中潜在的生物标志物。<br> 结果:<br> 1.45批党参药材含量测定结果显示,紫丁香苷的含量为0.0072-0.032mg/g,党参苷Ⅰ为0.2981-1.5637mg/g,党参炔苷为0.1287-1.0466mg/g,苍术内酯Ⅲ为0-0.0840mg/g。在不同基原党参药材中,不同基原党参中紫丁香苷的含量无统计学差异,党参苷Ⅰ在党参中的含量最高(plt;0.05);党参炔苷在素花党参和川党参的含量较高(plt;0.05);苍术内酯Ⅲ在党参中的含量最高(plt;0.05)。在不同规格党参药材中,紫丁香苷在纹党中的含量最高(plt;0.05);党参苷Ⅰ在潞党参中的含量最高(plt;0.05);党参炔苷在刀党中的含量最高(plt;0.05);苍术内酯Ⅲ在潞党参中的含量最高(plt;0.05)。HCA、PCA、OPLS-DA分析结果进一步验证,不同基原、不同规格间党参样品存在差异,可以进行区分。<br> 2.基于DES的DLPME-HPLC的最佳实验条件为:萃取剂为TOMAC-正丁醇,摩尔比为1:4、体积为110μL;样品相溶液pH为7;盐浓度为0%;分散剂选择甲醇,体积为300μL;萃取时间为90s;离心转速为6000rpm及离心时间为2min。方法学考察结果显示,党参炔苷的检测限(LOD)和定量限(LOQ)为6×10-4和2×10-3μg/mL,苍术内酯Ⅲ的LOD和LOQ分别为和3×10-3和9×10-3μg/mL,两种目标分析物的平均富集倍数(EF)分别为37和154。党参炔苷和苍术内酯Ⅲ的日内精密度RSD分别为1.5%-5.8%和2.6%-5.2%。日间精密度RSD值为1.2%-6.4%和3.1%-4.7%。平均回收率为87.6%-114.7%,RSD值为1.5%-4.7%。样品含量测定结果显示,党参炔苷的含量为0.204-0.927mg/g,苍术内酯Ⅲ的含量为0-0.1584mg/g。党参炔苷在素花党参含量最高(plt;0.05),苍术内酯Ⅲ在党参中的含量最高(plt;0.05)。相比常见的液液萃取法(LLE),该方法具有更低的LOD和LOQ以及更宽的线性范围的优点。<br> 3.HFCF-HPLC的实验条件为:采用聚丙烯中空纤维为细胞种植载体、样品溶液浓度为60mg/mL。该条件下,以细胞捕获因子(CFF)>1为标准,捕获到的化学成分依次为紫丁香苷、党参苷Ⅰ、党参炔苷宁、党参炔苷和苍术内酯Ⅲ。<br> 结论:<br> 本文对党参中紫丁香苷、党参苷Ⅰ、党参炔苷、苍术内酯Ⅲ进行多成分含量测定结合化学计量学分析结果显示,这四种小分子成分可作为化学标志物区分和比较不同基原、不同规格党参;基于DES的DLPME-HPLC富集和测定了党参中的党参炔苷和苍术内酯Ⅲ,通过比较两种成分的含量可区分三种不同基原的党参,同时为中药中微量成分的分析测定提供了新思路;应用HFCF-HPLC筛选党参中潜在的抗炎活性成分,为系统分析中药中潜在的生物活性成分提供了一种简便、快捷的体外筛选方法。综上所述,紫丁香苷、党参苷Ⅰ、党参炔苷宁、党参炔苷、苍术内酯Ⅲ可作为党参中的候选质量标志物。
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