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摘要目的：<br>　　口腔黏膜下纤维性变(oralsubmucousfibrosis,OSF)是胶原纤维在黏膜下层大量堆积的慢性进行性口腔黏膜疾病，具有癌变倾向，但缺乏有效、理想的治疗药物。黄芪(Astragalus,AST)是一种用药历史悠久的中药，其主要活性成分，如多糖类、黄酮类、皂苷类等,均具有抗纤维化作用，主要作用机制包括调控纤维化相关基因蛋白的表达，影响上皮间充质转化，调节炎症反应等。以上机制与OSF的发病密切相关，提示AST具有抗OSF的潜能。<br>　　本研究通过网络药理学方法分析AST抗OSF的潜在有效活性成分、核心作用靶点及主要影响的生物功能、信号通路，运用分子对接技术，分析成分-靶点结合的可能性，并进行细胞分子学实验不仅进一步验证以上分析的准确性，而且初步探索了AST抗OSF的潜在作用机制，为AST治疗OSF提供理论及细胞分子学实验依据。方法：<br>　　第一部分：ASI抗OSF的网络药理学分析<br>　　在中药数据库TCMSP筛选AST的活性成分，上传至SwissTargetPrediction数据库匹配对应靶点，汇总得到AST相关作用靶点；在疾病相关靶点数据库(GeneCards和OMIM数据库)检索OSF潜在治疗靶点，汇总、去重后得到OSF潜在治疗靶点；将AST及OSF相关靶点信息通过Venny分析得到“AST-OSF”交集靶点数据；将药物、成分、靶点、疾病数据信息通过Cytoscape软件两两匹配，构建“AST-成分-靶点-OSF”网络图；使用STRING数据库分析交集基因信息后进行PPI网络分析；并通过Metascape数据库对交集靶点进行GO生物功能和KEGG通路分析；将分析得到的药物活性成分及潜在作用靶点前五位通过Pymol、obgui、AuToDockTools-1.5.6等软件进行分子模拟对接，验证其结合可能性。<br>　　第二部分：ASI抗OSF的细胞分子学实验<br>　　制备不同浓度的槟榔碱(arecoline，ARE)、黄芪注射液(astragalusinjection,ASI),分别作用于口腔黏膜成纤维细胞(Oralmucousfibroblasts,OMF)24小时后，利用CCK-8法检测两种药物对OMF的细胞毒性。<br>　　利用含不同浓度ARE(0?g/ml、10?g/ml、20?g/ml、30?g/ml、40?g/ml)的培养基培养OMF24小时后，采用RT-qPCR法检测肌成纤维细胞标志蛋白——α-肌动蛋白-2,(actinalpha2,ACTA2)的表达量，以确定ARE刺激OMF转化为肌成纤维细胞的最佳浓度,后续实验采用最佳浓度建立肌成纤维细胞模型。并检测核心蛋白EGFR、VEGFAmRNA的表达，以明确ARE对两者的促进作用。<br>　　建立细胞模型后去除ARE刺激,使用含不同浓度ASI(100mg/ml、200mg/ml、300mg/ml、400mg/ml)的培养基培养，24小时后，采用RT-PCR检测标志蛋白ACTA2和预测的核心蛋白EGFR、AEGFAmRNA的表达量，从细胞分子学上进一步验证网络药理学数据的准确性，并初步探讨AST抗纤维化的潜在分子机制。<br>　　结果：<br>　　第一部分：ASI抗OSF的网络药理学分析<br>　　AST包含21个潜在有效成分可通过68个作用靶点，发挥抗OSF作用的。<br>　　分析“AST-成分-靶点-OSF”网络图得到AST的主要有效成分为华良姜素(Jaranol，JA)、3，9，-二-o-甲基尼森香豌豆紫檀酚(3,9-di-O-methylnissolin，39D)、异鼠李素(isorhamnetin，ISO)、黄芪紫檀烷苷(6AR)、山柰酚(kaempferol，KAE)等；<br>　　PPI分析AST主要作用于OSF时排名前五的的核心靶点为EGFR、VEGFA、MAPK3、HRAS、JUN等；<br>　　GO功能主要涉及损伤应答、蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性的调节、细胞成分运动的调节、调节胞外基质和磷酸转移酶活性等178种生物过程(BP)，65种细胞成分(CC)和63种分子功能(MF)；<br>　　KEGG通路富集分析发现AST作用于OSF的靶点主要影响PI3K-Akt、JAK-STAT等138条相关通路。<br>　　AST主要活性成分与核心靶点均有结合可能。<br>　　第二部分：ASI抗OSF的细胞分子学实验<br>　　不同浓度ARE和ASI分别刺激OMF24小时后，通过CCK-8法检测药物毒性,结果显示两种不同的药物均呈浓度依赖性的抑制OMF细胞活力，其IC50值分别为：120.0?g/ml、553.3mg/ml。<br>　　ARE刺激OMF后的RT-PCR实验结果显示，随着ARE浓度的增加，肌成纤维细胞标志物ACTA2及核心蛋白EGFR、VEGFAmRNA表达量明显升高。其中当ARE浓度为20?g/ml时，提高ACTA2、EGFR、VEGFAmRNA的表达(P＜0.01)，当ARE浓度为30?g/ml和40?g/ml时，显著提高ACTA2、EGFR、VEGFAmRNA的表达(P＜0.001)，提示ARE成功导致OMF向肌成纤维细胞转化，并促进EGFR、VEGFAmRNA的表达。<br>　　ASI干预后的RT-PCR结果显示，随着ASI浓度的增加，可抑制由ARE导致的ACTA2及EGFR、VEGFAmRNA表达升高。其中300mg/ml和400mg/ml的ASI下调ACTA2mRNA表达的效果显著(P＜0.05)；而100mg/ml的ASI可明显下调EGFR和VEGFAmRNA的表达(P＜0.05)，且随着ASI浓度增加，抑制效果增强。<br>　　结论：<br>　　1.网络药理学发现黄芪包含的华良姜素、3,9,-二-o-甲基尼森香豌豆紫檀酚、异鼠李素、黄芪紫檀烷苷、山柰酚等25个潜在有效成分，通过作用于EGFR、VEGFA等68个潜在作用靶点，影响损伤应答、蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性的调节、细胞成分运动的调节、调节胞外基质和磷酸转移酶活性等生物功能，并调控PI3K-Ak等信号通路发挥抗OSF的作用。<br>　　2.细胞实验中槟榔碱可诱导OMF活化为肌成纤维细胞并上调EGFR、VEGFAmRNA的表达，促进OSF的发生；而ASI可抑制由ARE导致OMF活化、下调核心靶点EGFR、VEGFA发挥抗OSF的作用。<br>　　3.ASI可能成为通过多成分、多靶点及途径抗OSF的有效药物。