MtROS调控脂代谢重编程促进糖尿病肾小管损伤的机制研究-论文-万方医学网

MtROS调控脂代谢重编程促进糖尿病肾小管损伤的机制研究

二维码有效期 120s

收藏纠错

摘要糖尿病肾脏病(Diabetickidneydisease,DKD)作为糖尿病最常见的微血管并发症之一，常发展至终末期肾脏病，且与慢性肾脏病患者的死亡率密切相关。尽管通过强化降血糖、降血脂、降低尿蛋白以及降压治疗，可延缓DKD进展至终末期肾脏病的速度，但仍不能有效阻断其进展至终末期肾脏病，因此尚需要深入探讨其发生及进展机制，以寻求临床治疗靶点。 　　糖尿病是代谢性疾病，存在多种代谢紊乱，肾脏作为体内静息代谢率最高的器官之一，是糖尿病微血管并发症的高风险器官。所以，研究糖尿病疾病状态下肾脏代谢改变对于攻克DKD意义重大。目前针对DKD发生发展过程中肾脏代谢改变的研究成果仍存在争议，部分研究表明DKD时肾脏发生(Fattyacidoxidation,FAO)减少，糖酵解增加的能量代谢重编，而新近代谢组学研究发现DKD时FAO及糖酵解通量均是增加的。目前针对DKD肾脏细胞代谢改变的研究主要基于肾脏皮质的组学数据。事实上，肾脏皮质包含多种细胞类型，且不同部位的细胞根据自身能量需求的不同，存在不同的能量偏好。在应对DKD代谢应激的时候，不同类型的肾脏细胞发生了怎样的代谢改变，在肾脏皮质整体水平上的研究显然是不够的。借助单细胞测序技术，获得整个肾组织中不同细胞类型的代谢信息无疑对DKD发病机制的研究有着重要意义。考虑到仅局限于转录组水平的研究，与细胞内真实的代谢改变可能存在不同，进一步进行相关靶向代谢组研究亦十分重要。 　　近年来，“DKD肾小管损伤为中心”观点被提出和证实，且肾小管上皮细胞能量代谢非常活跃，线粒体含量高，生理情况下高度依赖FAO产生ATP，所以脂代谢改变在肾小管细胞能量代谢重编中起着重要作用，此外其代谢灵活性差，理论上对糖尿病代谢紊乱造成的损伤更为敏感。肾小管上皮细胞脂代谢紊乱可引起肾脏脂质蓄积，进而引起细胞损伤。糖尿病时肾小管上皮细胞脂代谢改变伴随大量线粒体活性氧。MtROS能够通过影响基因稳定、代谢后修饰等多种方式改变代谢酶参与细胞代谢途径的调控。更加深入地理解肾小管上皮细胞脂代谢改变和MtROS的之间的相关机制至关重要。本课题，重点关注了MtROS在肾小管上皮细胞脂代谢改变中的可能作用。 　　目的： 　　（1）基于db/db小鼠肾脏单细胞转录组数据，绘制DKD肾脏细胞代谢图谱，探索DKD时肾脏不同细胞代谢改变； 　　（2）利用非靶向代谢组学对db/db小鼠肾皮质代谢物进行量化，识别差异代谢物，分析其生物学意义，以揭示DKD时肾皮质代谢机制； 　　（3）利用自发糖尿病模型db/db小鼠及体外培养的高糖诱导的人肾小管上皮细胞(Humanproximaltubularepithelialcells,HK-2)系，探讨MtROS在肾脏脂代谢重编及肾小管损伤中的作用。 　　方法： 　　（1）从GEO数据库中获取db/db小鼠肾脏单细胞转录组原始数据，进行数据过滤及标准化，对特定细胞类型进行亚聚类及注释，进而进行细胞差异基因分析、KEGG富集及细胞间通讯分析； 　　（2）以db/db小鼠为研究对象，采集肾皮质标本，使用液相色谱-质谱法对各组小鼠顺皮质代谢物进行量化，并进行多元统计分析识别差异代谢产物，并进一步对差异代谢产物进行KEGG富集分析； 　　（3）使用线粒体靶向ROS清除剂SS31干预8周龄的自发糖尿病db/db小鼠及体外培养的高糖刺激的HK-2细胞系，使用比色法、免疫组织化学染色、免疫荧光染色、Westernblot、电镜、流式细胞术等方法检测肾脏功能指标、尿白蛋白、肾小管损伤指标、肾组织病理学、脂滴蓄积情况、FAO相关酶(PPARα、CPT1a、ACOX1)、线粒体形态、线粒体膜电位、细胞ATP含量、细胞MtROS水平、线粒体生物发生指标（PGC-1α、p-AMPK）等，探讨MtROS在肾脏脂代谢重编及肾小管损伤中的作用。 　　结果： 　　（1）在各种肾脏细胞中，近端肾小管上皮细胞代谢通路的总体活性更高，更具有可塑性，糖代谢及脂代谢改变尤为显著，且近端肾小管上皮细胞与DKD免疫微环境调控密切相关，近端肾小管上皮细胞代谢改变可能是DKD时代谢重编程的主要原因； 　　（2）DKD肾皮质时存在代谢改变，代谢物改变涉及三羧酸循环、氧化磷酸化、亚麻酸代谢、甘油磷脂代谢、胆固醇代谢、胰高血糖素信号通路、胰岛素抵抗、碳代谢、醚脂类代谢、色氨酸代谢、嘌呤代谢、类固醇生物合成等；其中乙酰左旋肉碱及亚麻酸下降，甘油磷脂、溶血磷脂酰胆碱水平上升，提示DKD时可能存在脂代谢重编及肾小管间质损伤；三羧酸循环代谢产物柠檬酸下降，琥珀酸增加，而富马酸无明显变化，提示DKD时存在线粒体功能障碍，具体机制仍需进一步研究； 　　（3）MtROS介导糖尿病小鼠肾小管间质损伤及高糖诱导的HK-2细胞损伤，给予SS31清除MtROS可改善糖尿病小鼠肾小管间质损伤及高糖诱导的HK-2细胞损伤；MtROS促进糖尿病小鼠肾皮质及高糖诱导的HK-2细胞FAO障碍及脂质沉积，给予SS31清除MtROS可改善糖尿病小鼠肾皮质及高糖诱导的HK-2细胞FAO障碍及脂质沉积；改善高糖诱导的HK-2细胞FAO障碍，可改善高糖诱导的HK-2细胞脂质沉积及细胞损伤；MtROS促进糖尿病小鼠肾皮质及高糖诱导的HK-2线粒体损伤，给予SS31清除MtROS可改善糖尿病小鼠肾皮质及高糖诱导的HK-2细胞线粒体损伤。 　　结论： 　　（1）DKD时存在能量代谢重编，近端肾小管上皮细胞代谢改变可能是DKD时代谢重编程的主要原因； 　　（2）DKD时存在脂代谢重编、肾小管间质损伤及线粒体功能障碍； 　　（3）MtROS促进DKD时肾小管上皮细胞脂质沉积、细胞损伤及线粒体损伤； 　　（4）MtROS可通过影响FAO促进糖尿病肾小管损伤。