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摘要第一部分新型载药纳米粒子的构建、表征及生物相容性研究<br>　　研究背景主动脉夹层（aorticdissection,AD）是一种致死风险极高的主动脉病变，目前的治疗干预方法有开放手术、腔内隔绝术以及药物保守治疗。血管外科医生在临床工作中发现一种主动脉夹层早期病变形式，表现为CTA影像中主动脉管壁内膜的充盈缺损和龛影，对应的病理类型为主动脉管壁内膜的局部缺损以及穿透性溃疡。这类患者既达不到开放手术以及腔内手术的治疗指征，保守治疗的措施也有限，有几率发展为典型致死性的主动脉夹层病变。对于临床医生来说，需要一种针对早期病变的干预手段。纳米药物递送系统以纳米载体的形式将负载药物输送到特定病变部位进行干预，为我们提供了新的思路。而组蛋白去乙酰化酶7衍生肽（HDAC-7A）是一种小分子活性多肽，具有促进血管壁上干细胞抗原1阳性（Sca-1+）的血管祖细胞（VPCs）向内膜迁移分化的生物效应。<br>　　研究目的构建一种生物相容性良好的，具有主动脉夹层靶向性的，可静脉注射的新型载HDAC-7A纳米粒子（7ANPs）。通过实验对构建粒子的表征、稳定性、药物释放行为以及生物相容性进行检测。<br>　　研究方法乙二醇壳聚糖（GC）接支聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）形成高分子聚合物GC-PLGA。用纳米沉淀法将GC-PLGA负载HDAC-7A形成纳米粒子。获取红细胞膜并对其表面进行靶向配体修饰后，对纳米粒子进行包裹完成构建。通过异硫氰酸荧光素（FITC）对HDAC-7A进行标记，荧光分光光度计测定纳米粒子的包封率（EE）以及载药率（DL）。核磁共振氢谱（1H-NMR）、傅里叶红外光谱（FTIR）、粒径仪（DLS）、激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）、扫描电镜（SEM）、透射电镜（TEM）对载药纳米粒子合成过程进行表征。对合成的粒子进行稳定性测试、药物释放行为测试以及细胞毒性实验、溶血实验。<br>　　结果1H-NMR证实PLGA成功的接上GC,FTIR证实GC-PLGA负载HDAC-7A形成载药纳米粒子（7ANPs），DLS测定纳米粒子平均粒径为230nm，表面电位-3mV，扫描电镜下颗粒形貌良好，LSCM表征了Ⅳ型胶原靶向肽的成功插入细胞膜。平均粒径、表面电位的变化以及透射电镜观测证实细胞膜对粒子的包裹。计算纳米粒子的包封率为79.2%，载药率为21.6%。药物释放累计曲线显示载药纳米粒子48小时药物累计释放85%。细胞毒性实验结果提示无明显细胞毒性作用，溶血试验结果显示溶血率小于5%。<br>　　结论完成了红细胞包膜的负载有HDAC-7A的GC-PLGA纳米粒子（7ANPs）的构建，对包封率、载药率以及相应的表征进行了检测。完成了稳定性、生物相容性以及药物释放行为的测试。<br>　　第二部分新型载药纳米粒子对主动脉夹层的靶向修复作用研究<br>　　研究背景主动脉夹层（aorticdissection,AD）致死率高、危害性大，未经治疗的典型急性主动脉夹层患者，6小时内病死率超过23%，4小时内病死率超过50%。开放手术治疗是主动脉夹层传统的主要干预手段，而新兴的腔内治疗技术相比传统的开放手术有着创伤小、出血少、手术时间短等优势，但也有几率发生内漏、近端逆撕、远端扩张等不良事件。随着临床计算机断层扫描血管成像技术分辨率及普及率的提高，表现为不同程度内膜损伤的夹层早期病变得以发现，针对这类早期病变，目前还缺乏针对性的干预策略。组蛋白去乙酰化酶7衍生肽（HDAC-7A）具有促进干细胞抗原1阳性（Sca1+）的血管祖细胞（VPCs）向血管内膜的迁移分化的效应，具有治疗血管损伤的应用潜能，另外Ⅳ型胶原（typeⅣCollagen,ColⅣ）作为内膜基底层的的相对特异性胶原，在血管损伤暴露增加，可作为靶向干预血管损伤的靶标。因此本课题上一部分构建了一套新型纳米药物递送系统，通过粒子表面修饰的Ⅳ型胶原靶向肽（）的主动靶向，将组蛋白去乙酰化酶7衍生肽（HDAC-7A）输送到主动脉夹层损伤部位进行干预。在此部分，将对构建的纳米粒子系统开展细胞以及动物实验研究。<br>　　研究目的通过细胞以及动物实验，对前期构建合成的新型载HDAC-7A纳米粒子的生物效应以及靶向性进行检验，并研究运用新型粒子对主动脉夹层小鼠进行尾静脉注射干预的修复效应。<br>　　研究方法细胞实验部分：解剖分离C57BL/6野生小鼠主动脉外膜组织，提取原代外膜细胞培育，通过磁珠分选使Sca-1+VPCs达到90%阳性率后，设置为以下几组：①纯药物干预组（Free7A组）；②载药纳米粒子组（EM/7ANPs-ColⅣ组）；③未载药纳米粒子组（EM/NPs-ColⅣ组）④空白对照组（PBS组），依次开展划痕实验以及Transwell实验，研究不同干预方式对VPCs迁移侵袭能力的影响，开展分化实验。α-SMA、CD31、Sca1+免疫荧光染色，研究不同干预方式对VPCs分化趋势的影响。动物实验部分：使用C57BL/6J小鼠进行主动脉夹层造模，Ⅳ型胶原免疫荧光染色分析研究Ⅳ型胶原在主动脉形成部位含量及分布情况；通过荧光成像设备，研究纳米粒子尾静脉注射后在主动脉夹层小鼠的体内靶向效应，并使用荧光强度以及组织重量的比值对靶向聚集效果进行量化分析；将其余主动脉夹层小鼠进行随机分组：①纯药物干预组（Free7A组）；②载药纳米粒子组（EM/7ANPs-ColⅣ组）；③未载药纳米粒子组（EM/NPs-ColⅣ组）④空白对照组（PBS组）。并另设以一组假手术组（ShamOperation组）。①-④组分别通过尾静脉注射单纯HDAC-7A、新型载药纳米粒子(EM/7ANPs-ColⅣ)、空白纳米粒子组（EM/NPs-ColⅣ）以及PBS溶液进行干预。记录生存数据，分析不同干预对小鼠生存率的影响；利用小动物超声检测小鼠主动脉的内径，分析不同干预方式对夹层小鼠主动脉扩张的影响；通过大体标本以及病理切片的分析，研究干预方式对夹层病变严重程度的影响；通过EVG、Masson特殊染色，分析弹力纤维、胶原纤维以及胶原容积含量，研究干预方式对夹层小鼠主动脉管壁稳定性的影响，通过Sca-1以及CD31免疫荧光染色，研究不同干预方式对主动脉内皮覆盖的影响，分析不同干预方式对主动脉管壁上VPCs的生物学效应。<br>　　结果细胞实验部分：成功分离培育了Sca-1+阳性率90%以上的VPCs，划痕实验于划痕后0小时、24小时、48小时、72小时分别进行拍照，ImageJ软件量化分析划痕愈合速度，结果显示，单纯药物组以及载药粒子组划痕愈合速度与空白对照组比均有显著提高（P＜0.01）。Transwell实验在加药24小时后观察穿膜细胞并计数分析，结果显示，单纯药物组以及载药粒子组的穿膜细胞计数比空白对照组均有显著增加（P＜0.01）。分化实验72小时结果显示，单纯药物组以及载药粒子组的物CD31内皮分化标记的平均荧光强度与空白对照组均有显著增强（P＜0.01）。动物实验部分：Ⅳ型胶原免疫荧光染色结果提示，主动脉夹层损伤部位Ⅳ型胶原含量显著高于未损伤部位，P＜0.01，切胶原含量多集中在血管内膜侧。荧光靶向实验观察到新型纳米粒子在主动脉弓降部夹层形成部位的聚集，量化分析结果提示，静脉注射90分钟后，新型纳米粒子在主动脉夹层达到最大聚集效果。纳入分组干预的主动脉夹层小鼠共48只，每组为12只。超声检查结果提示PBS对照组与未载药粒子组的升主动脉截面比假手术组有所扩大，有统计学差异（P＜0.05），单纯药物组以及载药粒子组与假手术组比无统计学差异，通过大体标本以及组织切片HE染色结果提示，载药纳米粒子组的典型及更严重病变率较空白对照组明显降低，具有统计学差异（P＜0.05）。Masson染色结果提示，载药粒子组的胶原容积分数比PBS对照组高（P＜0.05），免疫荧光染色结果提示，各夹层实验干预组的CD31内膜覆盖率均比假手术组显著降低（P＜0.01），实验干预组内进行比较时，载药粒子干预组的CD31内膜覆盖率高于空白对照组（P＜0.05）。Sca-1免疫荧光结果提斯，夹层实验干预组血管内膜侧的Sca-1阳性率均高于假手术组，实验干预组内进行比较时，载药纳米粒子干预组血管内膜侧的Sca-1阳性率比空白对照组明显升高。<br>　　结论构建的新型载药纳米粒子具有促进Sca-1+VPCs迁移、侵袭以及向内皮细胞分化的能力。主动脉夹层形成的血管损伤部位，Ⅳ型胶原含量显著增高，构建的新型纳米粒子通过特异性配体实现了主动脉夹层损伤部位的靶向聚集。尾静脉给药干预实验表明，新型纳米粒子明显促进了外膜层的VPCs向内膜侧迁移、侵袭。明显提高了内膜侧内皮细胞的覆盖率，并增加了血管壁中膜层胶原含量。一定程度上起到了延缓轻微内膜损伤向典型主动脉夹层进展的作用。