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摘要【研究背景】<br>　　脊髓损伤（Spinalcordinjury，SCI）可导致永久性神经功能障碍，对患者生活及社会经济造成巨大的负担。脊髓损伤可分为原发性和继发性脊髓损伤，原发性脊髓损伤为不可逆过程，而继发性脊髓损伤为可逆的病理过程，可通过多种途径进行干预。现有外科手术和保守治疗等方法仍存在局限性，研究表明抑制继发性脊髓损伤和拯救破损神经元或是治疗脊髓损伤疾病的关键。因此，探索脊髓损伤疾病相关的生物标记物，明确治疗靶点以获得更佳疗效，为进一步探究其病理机制奠定基础。<br>　　近来发现免疫抑制剂可竞争性阻断炎症因子与其受体结合，进而抑制炎症因子功能，减缓脊髓损伤的程度，对早期脊髓损伤患者治疗具有重要价值，而明确作用靶点能将免疫抑制剂的效力最大化。因此，识别有助于诊治的生物标记物对改善脊髓损伤患者的预后意义重大，并为免疫靶点治疗提供参考。<br>　　【研究目的】<br>　　本研究首先通过生物信息学策略筛选鉴定脊髓损伤芯片样本的标记物，然后经过分子生物学实验和组织学实验验证标记物在脊髓损伤过程中的价值。最后围绕生物信息学分析结果选择合适的免疫抑制剂，开展脊髓损伤动物模型治疗实验，观察药物疗效，进一步明确标记物的指导意义。<br>　　【研究方法】<br>　　第一部分：生物信息学技术筛选鉴定脊髓损伤芯片样本中的标记物<br>　　从NCBIGEO公共数据库下载GSE5296和GSE47681后进行数据矫正以去除批次效应，探讨疾病相关分子机制的差异，并下载GSE45006数据集用于后续验证。为了获得与疾病发生发展所涉及的生物学功能和信号通路，使用DAVID数据库进行功能注释和可视化，对特定基因进行基因本体（GO）分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析。再使用Lassologistic回归和Boruta算法对疾病的标志物进行特征选择。然后采用ssGSEA、CIBERSORT和GSVA算法阐明免疫浸润和信号通路与生物标志物的相关性。最后使用R语言统计分析，所有统计检验均为双侧，P值lt;0.05具有统计学意义。<br>　　第二部分：验证筛选标记物在脊髓损伤疾病中的价值<br>　　将同一批次雄性SD大鼠，体重约为180-200g，随机分为3组：正常组（normal组），假手术组（Sham组）和脊髓损伤组（SCI组）。Sham组仅接受椎板切除术，SCI组采用Allen’s方法构建脊髓损伤大鼠模型，获取损伤的脊髓组织，通过RT-qPCR，Westernblot和免疫组织化学等实验检测所筛选标记物的表达水平和时序性特点，使用苏木精-伊红染色检测脊髓组织损伤情况，为后续免疫抑制治疗奠定基础。<br>　　第三部分：比较脊髓损伤大鼠免疫抑制治疗前后的功能恢复情况以及标记物的表达变化<br>　　根据生物信息学技术分析结果选择合适的免疫抑制剂，构建脊髓损伤动物模型，开展药物治疗实验并观察疗效，进一步明确标记物的指导意义。将同一批次雄性SD大鼠，体重约180-200g，随机分成四组，假手术组（Sham组），脊髓损伤对照组（生理盐水治疗，NS组），脊髓损伤治疗一组（Anakinra药物治疗，SA）和脊髓损伤治疗二组（VX765药物治疗，SV）。Sham组仅接受椎板切除处理，并在L5/6节段置管，每日鞘内注射5μl生理盐水；NS组构建SCI模型并置管，每日鞘内注射5μl生理盐水；SA组构建SCI模型并置管，每日鞘内注射5μl5mol/μlAnakinra；SV组构建SCI模型并置管，每日鞘内注射5μl5mol/μlVX765。鞘内注射持续时间为1周，1周后拔除置管。<br>　　通过BBB（Basso、Beattie、BresnahanScales）功能评分、足印实验和游泳实验评估脊髓损伤大鼠免疫治疗前后的运动情况，并通过RT-qPCR，Westernblot和免疫组织化学等实验验证炎症相关蛋白和筛选标记物的表达情况，再用HE实验观察脊髓组织的大体修复情况，最后用免疫荧光实验检测脊髓组织中焦亡通路蛋白的免疫表达水平。<br>　　【研究结果】<br>　　将GSE5296和GSE47681数据经过去除批次效应处理后合并分析，共筛选出182个差异表达基因，其中上调差异基因178个，下调基因4个。功能富集分析显示，DEGs与炎症反应、破骨细胞分化、髓系白细胞激活、调节细胞因子产生以及正调节免疫反应等生物学过程密切相关。在满足高置信度和隐藏非相互作用蛋白的限制下，选择差异基因构建一个PPI网络，显示有128个节点和934条边。然后使用Lasso回归和Boruta机器学习算法分别筛选出15个和43个差异基因可作为脊髓损伤疾病的标记物，并用GSE45006数据集验证脊髓损伤疾病的差异基因，三者取交集后发现共有3个差异基因IL1R1，IGSF6和CASP4可作为脊髓损伤疾病的生物标记物，且三个标记物IL1R1(AUC=0.942)，IGSF6(AUC=0.907)和CASP4（AUC=0.883）与疾病的关联程度极为密切。借助CIBERSORT算法分析脊髓损伤疾病相关的免疫浸润，结果显示抗原提呈细胞，巨噬细胞，调节性T细胞和肿瘤浸润淋巴细胞比例增加。标记物与免疫细胞相关性分析结果提示CASP4与副炎症呈正相关，与树突状细胞呈负相关;IGSF6与肿瘤浸润淋巴细胞和巨噬细胞呈正相关，与树突状细胞和中性粒细胞呈负相关;IL1R1与调节性T细胞和副炎症呈正相关，与树突状细胞呈负相关。通过使用GSVA算法对三种生物标志物的生物学效应进行整体评估，结果显示IL1R1与IL6-JAK-Akt信号通路，TNFα介导NFκB信号通路和干扰素γ反应的激活相关，与胰岛β细胞和Kras信号的抑制相关；CASP4亦与IL6-JAK-Akt信号通路，TNFα介导NFκB信号通路和干扰素γ反应的激活相关，与胰岛β细胞和氧化磷酸化反应的抑制相关；IGSF6与IL6-JAK-Akt信号通路，干扰素γ反应和炎症反应的激活相关，与氧化磷酸化反应和Kras信号的抑制相关。<br>　　采用Allen’s方法构建模型，若大鼠尾出现痉挛性摆动，双下肢及躯体回缩扑动，提示SCI造模成功。标记物时间表达曲线结果显示：IL1R1于mRNA水平在损伤后1天达到高峰，其蛋白水平亦于损伤后1天到达峰值；CASP4和IGSF6于mRNA水平在损伤后5天达到高峰，其蛋白水平亦于损伤后5天达到峰值。HE结果显示较Sham组，SCI组脊髓组织炎性细胞浸润，组织结构紊乱，出现空洞和坏死。Westernblot，RT-qPCR和免疫组织化学结果显示三个标记物在损伤的脊髓组织中表达上调，具有统计学意义（P值lt;0.05），充分证明了生物信息学技术分析结果的可靠性。<br>　　针对脊髓损伤疾病标记物进行免疫抑制治疗，并选择合适剂量的免疫抑制剂治疗SCI大鼠1周并进行长期观察。SA组和SV组于脊髓损伤后7天、14天、21天和28天的BBB评分均高于对照NS组（P值lt;0.05）。路易斯维尔游泳量表（LouisvilleswimScale,LSS）从前肢依赖、后肢运动、交替、躯干不稳定性和身体角度等方面对动物游泳姿势进行评分：从损伤后第7天开始，SA组和SV组大鼠较NS组游泳时前肢依赖更少，后肢交替更快，身体与水面之间的角度更小（P值＜0.05）。在损伤后28天的足迹分析中，SA和SV组大鼠的后肢协调改善，脚趾拖曳减轻，而与此相反，NS组大鼠协调能力差，脚趾拖曳明显，进一步说明免疫抑制剂可促进脊髓损伤大鼠功能改善（P值＜0.05）。<br>　　经过1周治疗后，分别获取四组脊髓组织进行检测炎症指标。NLRP3,NFκB,GSDMD,IL1β和ASC与细胞焦亡过程密切相关，CASP3和Bcl2与细胞凋亡过程联系紧密。Westernblot结果显示SA组和SV组的NLRP3,NFκB,GSDMD,IL1β,ASC,CASP3和Bcl2的蛋白水平介于Sham组和NS组，进一步证明细胞焦亡和凋亡参与了SCI后的级联反应。另一方面，IL1R1蛋白水平在Sham组中表达最低，NS组最高，SA组和SV组介于两者之间；CASP4蛋白在Sham组不表达，NS组最高，SA组和SV组表达衰减。RT-qPCR结果提示治疗组SA和SV组标记物mRNA水平均低于NS组（P值＜0.05）。免疫组织化学结果反馈治疗组标记物IL1R1和CASP4表达较NS组显著减少（P值＜0.05），并且SA和SV组脊髓组织形态HE染色结果较NS组炎症浸润细胞减少，组织形态更为清楚，空洞坏死有限，修复效果良好。免疫荧光结果示治疗组TUNEL（绿光）和磷酸化-NFκB-p65（红光）明显降低，入核数目减少，充分说明免疫抑制剂减弱脊髓损伤后的炎症反应并促进脊髓组织的形态和功能重建。<br>　　【研究结论】<br>　　1、通过生物信息学技术筛选鉴定IL1R1，CASP4和IGSF6作为脊髓损伤疾病的生物标记物和治疗靶点。<br>　　2、IL1R1，CASP4和IGSF6三个标记物在脊髓损伤疾病中高表达，或共同参与焦亡过程促进神经炎症和细胞死亡。<br>　　3、使用靶向标记物的免疫抑制治疗脊髓损伤大鼠，可显著改善其运动能力，降低炎症水平和促进脊髓组织修复。