侵袭性念珠菌感染患者致病菌菌种分布及体外药敏分析-论文-万方医学网

侵袭性念珠菌感染患者致病菌菌种分布及体外药敏分析

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摘要侵袭性念珠菌感染是临床较常见的侵袭性真菌感染，具有发病率高、死亡率高和诊疗费用高等特点。白念珠菌（Candida albicans）虽然仍是侵袭性念珠菌感染最常见的病原菌，但近年来非白念珠菌感染发生率正逐步上升，且存在引起暴发的潜在威胁。临床常用的系统抗真菌药物主要包括三唑类、多烯类及棘白菌素类等，其中棘白菌素类是目前治疗侵袭性念珠菌感染的首选药物。随着抗真菌药物在临床的大量使用，念珠菌属的耐药性日趋严重，“超级真菌”耳念珠菌（Candida auris）等新病原体不断涌现。上述抗真菌药物将无法满足临床需求，侵袭性念珠菌感染患者死亡率仍居高不下。 　　第一部分侵袭性念珠菌感染患者致病菌菌株收集及菌种鉴定 　　目的： 　　分析侵袭性念珠菌感染患者流行病学特征，掌握致病菌菌种分布特点。 　　方法： 　　收集2015年至2019年间来上海长征医院就诊的侵袭性念珠菌感染患者检出的念珠菌菌株，系统整理患者相关临床信息，包括性别、年龄、就诊科室、主要诊断等。采用两个不同的真菌通用引物ITS1/ITS4和D1/D2对实验菌株DNA样本进行PCR扩增并测序，菌株可鉴定至菌种水平。 　　结果： 　　纳入本研究的菌株共107株，来源于107例患者。白念珠菌31株，近平滑念珠菌复合体（Candida parapsilosis complex）34株（近平滑念珠菌（Candida parapsilosis）30株、拟平滑念珠菌（Candida orthopsilosis）3株、似平滑念珠菌（Candida metapsilosis）1株），光滑念珠菌（Candida glabrata）17株，热带念珠菌（Candida tropicalis）14株，季也蒙念珠菌（Candida guilliermondii）5株，希木龙念珠菌（Candida haemulonii）4株，克柔念珠菌（Candida krusei）2株。57株来源于血液标本，50株来源于导管、穿刺液、透析液及腹水等其他无菌标本。男性63例，女性44例。年龄分布为18~87岁，平均59.03±14.61岁，≥60岁的患者62例。来源科室前三位分别为急救科28例、肾内科18例、普外科14例。临床诊断主要以急危重症、肿瘤、手术、肾脏疾病等自身免疫功能受损疾病为主。以分子生物学测序结果为依据，采用常规手段对实验菌株菌种进行初步鉴定，12.15%的菌株菌种鉴定结果出现偏差。 　　结论： 　　本研究收集到的念珠菌菌株主要包括白念珠菌、近平滑念珠菌复合体、光滑念珠菌、热带念珠菌、季也蒙念珠菌、希木龙念珠菌、克柔念珠菌等7个菌种。白念珠菌虽仍是最主要的菌种类型，但非白念珠菌所占比例高达71.03%。血液标本来源以近平滑念珠菌复合体占比最高，其他无菌标本来源以白念珠菌占比最高。感染好发于老年患者及自身免疫功能受损的人群，男性患者比例高于女性患者。与传统的形态学和生化检测方法相比，分子生物学技术具有敏感性高、特异性高及检测时间短等优点。 　　第二部分体外抗真菌药物敏感性试验 　　目的： 　　掌握侵袭性念珠菌感染致病菌对不同抗真菌药物的体外敏感性，为临床抗真菌药物应用提供参考依据。 　　方法： 　　采用美国临床实验室标准化协会推荐的M27-A3酵母菌稀释法检测实验菌株对氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、泊沙康唑、卡泊芬净、米卡芬净、阿尼芬净、两性霉素B、5-氟胞嘧啶等9种抗真菌药物的体外敏感性。 　　结果： 　　白念珠菌对4种三唑类药物的敏感率均超过80%，96.77%的菌株对3种棘白菌素类药物均敏感，所有菌株对两性霉素B和5-氟胞嘧啶均敏感。近平滑念珠菌和似平滑念珠菌未发现耐药菌株，2株拟平滑念珠菌对氟康唑、伏立康唑、卡泊芬净交叉耐药，同时近平滑念珠菌复合体对三唑类药物的MIC较低，而对棘白菌素类药物的MIC较高。光滑念珠菌和热带念珠菌对4种三唑类药物的耐药率均较高，光滑念珠菌对棘白菌素类药物和两性霉素B均敏感，1株热带念珠菌对米卡芬净单药耐药，所有热带念珠菌对两性霉素B均敏感，各有1株光滑念珠菌和1株热带念珠菌对5-氟胞嘧啶耐药。除2株菌株对5-氟胞嘧啶单药耐药外，季也蒙念珠菌对其他药物均敏感，对伏立康唑的MIC较低，对棘白菌素类药物的MIC较高。希木龙念珠菌对3种棘白菌素类药物均敏感，对其余药物均有耐药现象出现。克柔念珠菌对氟康唑天然耐药，对其余药物均未出现耐药现象。 　　结论： 　　白念珠菌对三唑类药物虽有交叉耐药现象出现，但并未发生大规模耐药，对棘白菌素类药物敏感性好。近平滑念珠菌和似平滑念珠菌侵袭性感染经验性治疗可首选三唑类药物，拟平滑念珠菌侵袭性感染应谨慎采用氟康唑、伏立康唑或卡泊芬净进行治疗。棘白菌素类药物是治疗光滑念珠菌和热带念珠菌侵袭性感染的一线方案。季也蒙念珠菌侵袭性感染治疗首选伏立康唑。希木龙念珠菌侵袭性感染治疗可首选棘白菌素类药物。克柔念珠菌侵袭性感染治疗除氟康唑外其余药物均在可考虑范围内。除希木龙念珠菌外，两性霉素B和5-氟胞嘧啶对念珠菌属总体敏感性较好。 　　第三部分氟康唑耐药热带念珠菌转录组学研究 　　目的： 　　采用转录组测序技术研究氟康唑耐药热带念珠菌在氟康唑暴露时的转录调控现象，分析与药物相关的基因和通路，尝试探究耐药机制。 　　方法： 　　采用氟康唑对耐药热带念珠菌菌株进行处理，使用RNA-seq对转录本进行测序，测序结果在经过质控后回比到参考基因组，分析转录本基因的功能，使用的参考数据库有NR、KEGG、EggNOG、SwissProt、CAZy、MERPOS、PHI、真菌P450酶数据库，分析差异表达基因并富集差异表达的通路和功能，使用AlphaFold预测蛋白质结构，使用Foldseek搜索同源结构。 　　结果： 　　选取Candida tropicalis MYA-3404作为参考基因组（GenBank Accession：GCF_000006335.3），比对率从95.25%到95.67%不等，共检测到表达的基因数量为6182个。6个样本比对到CDS区域的读段超过了99%。共有188个基因被预测为肽酶，有226个基因编码碳水化合物活性相关酶，预测有超过1000个蛋白质编码基因与热带念珠菌的致病性有关，鉴定出198种潜在的CYP450。以TPM为定量指标，共筛选出了160个差异表达基因，其中66个上调，94个下调。通路富集主要集中在硫元素代谢、丙酮酸代谢、糖酵解和糖异生、氨基酸代谢、不饱和脂肪酸合成和有丝分裂。差异基因功能大量富集于膜的内在组分、转运和氧化还原。CTRG_03267的结构注释和功能预测为鸟氨酸羟化酶，参与膜组分的改变。 　　结论： 　　本研究针对1株氟康唑耐药热带念珠菌进行研究，使用RNA-seq研究了该菌株在添加氟康唑时对药物胁迫的转录调控现象，推测该菌株的耐药性主要来源于对转运蛋白的过表达调控和对膜组分的改变，以及收紧氨基酸合成和能量代谢来降低生长速度实现的。同时，对一个高表达但是没有功能注释的基因进行了结构预测和功能注释，获得了具有高置信度的结构预测模型，预测该基因的产物是一个鸟氨酸羟化酶，通过对该酶表达的上调实现了对膜组分的调整。