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摘要研究背景及目的：<br>　　银屑病是一种免疫介导的慢性炎症性皮肤病，累及全球约3%的人口，我国患病率约为0.47%。其组织病理特征是表皮角质形成细胞的过度增殖、异常分化和真皮炎症细胞的浸润，临床上表现为覆有银白色鳞屑的红色丘疹、斑块，常以头皮、背部、四肢伸侧受累多见。银屑病的发病机制尚不明确，目前普遍认为是遗传、环境和免疫因素共同作用的结果，而免疫因素中，活化的角质形成细胞和浸润的炎症细胞之间的相互作用是疾病发生发展的重要原因。针对轻中度银屑病患者以局部治疗为主，光疗、口服药物或者注射生物制剂是治疗重度患者的重要手段。<br>　　树突状细胞（DCs）是一种功能强大的抗原提呈细胞，在自身免疫性疾病和免疫耐受诱导中都发挥了至关重要的作用，以往的研究表明DCs也参与了银屑病的发生与发展。DCs起源于CD34＋的骨髓多功能造血干细胞，随血液分布于非淋巴组织及实质器官，并发育成为未成熟DC，在炎症介质的刺激和作用下成熟，通过淋巴管迁移至淋巴结内，分泌趋化因子和细胞因子来激活T淋巴细胞，产生特异性免疫应答。皮肤中的DCs包括LCs（朗格汉斯细胞）、pDCs（浆细胞样树突状细胞）和mDCs（髓样树突状细胞），真皮中的DCs主要为mDCs。在银屑病样皮损中检测DCs，发现共刺激分子CD83、CD86表达增加。此外，有研究表明，银屑病皮损中受损的角质形成细胞会释放自身核苷酸，与LL-37形成LL-37-自身核苷酸复合物，刺激pDCs产生I型干扰素，导致mDCs成熟和活化。成熟的DCs能够产生IL-12和IL-23，激活和刺激Th1/Th17细胞，形成DC-T细胞簇，最终驱动T细胞的原位活化，而T细胞产生效应细胞因子，诱导角质形成细胞的增殖和异常分化是银屑病的重要特征。综上所述，探究DCs与角质形成细胞之间的相互作用，是国内外重要的研究方向。<br>　　近年来，许多研究显示外泌体是细胞间通讯的重要介质，它是纳米大小（30-150nm）的囊外小泡，是内溶酶体途径的产物，可以携带和转移各种蛋白质、RNA和脂类，为许多疾病的机制研究提供了新的方向。在炎症性疾病中，越来越多的证据表明外泌体可能来自多种细胞类型，如上皮细胞、巨噬细胞、DCs和淋巴细胞等。角质形成细胞是表皮的主要成分，参与银屑病皮损的形成，还能影响表皮的微环境，并影响免疫细胞在疾病中的功能。已有研究表明，角质形成细胞能分泌外泌体通过促进中性粒细胞的活化和影响Th1/Th2极化促进银屑病的发生发展。本课题拟研究角质形成细胞来源外泌体对DCs功能的影响及其相关机制，从而为外泌体在银屑病发生发展中发挥的作用及机制研究奠定一定的基础，从而为银屑病的治疗新方向提供研究基础。本课题主要包括以下三个部分：<br>　　第一部分角质形成细胞来源外泌体对树突状细胞功能的影响<br>　　方法：<br>　　1、使用HaCaT角质形成细胞系，细胞因子处理细胞模拟银屑病状态的角质形成细胞，使用差速离心法从两组细胞培养上清中分离纯化外泌体，并分别对外泌体进行鉴定。<br>　　2、采集健康人外周血，抽提PBMC并诱导培养树突状细胞。<br>　　3、将细胞因子处理和未处理的HaCaT角质形成细胞来源外泌体与部分成熟树突状细胞共孵育，测定树突状细胞表面共刺激分子表达，酶联免疫吸附法（ELISA）测定细胞培养上清中细胞因子IL-12和IL-23的表达。<br>　　结果：<br>　　1、分别从细胞因子处理和未处理HaCaT角质形成细胞培养上清中分离纯化提取的两组囊泡符合外泌体直径和形态特征，且两组外泌体分泌量无明显差异。<br>　　2、两组外泌体分别与部分成熟的树突状细胞共孵育后，细胞因子处理组的树突状细胞表面共刺激分子表达增加，且上清中细胞因子IL-12、IL-23含量增加。<br>　　第二部分角质形成细胞来源外泌体影响树突状细胞功能的机制研究<br>　　方法：<br>　　1、从细胞因子处理和未处理HaCaT角质形成细胞来源外泌体中分别提取RNA，RNA-seq和qRT-PCR技术检测并验证细胞因子处理组外泌体中高表达的miRNA分子。<br>　　2、通过生物信息学网站StarBase对高表达的具体miRNA分子的下游进行预测，筛选并检索文献，选取具体分子作为miRNA的靶点进行研究。<br>　　3、将细胞因子处理和未处理HaCaT角质形成细胞来源外泌体，与未成熟树突状细胞共孵育，通过免疫印迹法和双荧光素酶报告基因检测验证miRNA分子的作用。<br>　　结果：<br>　　1、提取细胞因子处理和未处理HaCaT角质形成细胞来源外泌体中的RNA进行测序，选取差异表达最显著的五条：miR-11615、miR-378、miR-7054、miR-6650、miR-1692进行研究。qRT-PCR技术检测细胞因子处理组和未处理组HaCaT角质形成细胞、两组角质形成细胞来源外泌体、以及分别与两组外泌体共孵育的树突状细胞中这五条miRNA的表达情况，发现miRNA-378高表达且具有统计学意义。<br>　　2、通过生物信息学网站StarBase对miR-378的下游进行预测，并筛选出了其中两个以上网站支持的靶点，通过检索和阅读文献，我们最终将RORA作为后续研究的分子。<br>　　3、通过免疫印迹法检测两组角质形成细胞、和外泌体以及与外泌体共孵育后的树突状细胞中RORA的表达水平，我们发现细胞因子处理组的树突状细胞中RORA水平显著下降，而过表达miR-378可以降低RORA的表达水平，抑制miR-378后RORA表达水平上升。<br>　　第三部分小鼠角质形成细胞通过外泌体对小鼠银屑病模型的影响及机制研究<br>　　方法：<br>　　1、选取6-8周龄的Balb/c雌鼠，5%的咪喹莫特乳膏（IMQ）50mg/天涂抹耳部皮肤，对照组选用凡士林50mg构造小鼠耳银屑病模型，处死小鼠后取耳并分离真表皮，分离培养小鼠耳表皮中的角质形成细胞，24小时后分离纯化对照组和IMQ组小鼠角质形成细胞上清中的外泌体。<br>　　2、分离培养控制组和IMQ组小鼠耳表皮中的角质形成细胞，敲低IMQ组小鼠角质形成细胞中miR-378浓度，过表达对照组小鼠角质形成细胞中的miR-378，分别分离纯化四组细胞上清中的外泌体。选取6-8周龄的Balb/c雌鼠，5%的咪喹莫特乳膏（IMQ）50mg/天涂抹耳部皮肤，构造小鼠耳银屑病模型，同时分别予PBS、对照组外泌体、IMQ组外泌体、对照组敲低miR-378外泌体、IMQ组过表达miR-378外泌体20μg皮下注射，7天后处死小鼠取耳，通过HE染色、免疫组化染色评估小鼠皮损严重程度，流式细胞学检测真皮树突状细胞表面共刺激分子表达。<br>　　结果：<br>　　在第8天时颈椎脱臼法处死小鼠取耳皮肤标本，行HE染色和免疫组织化学染色（Ki67）评估皮损炎症的严重程度发现较正常KC组，银屑病KC组和正常KC过表达miR-378组皮肤炎症加重，鳞屑增多，表皮增厚，且真皮内浸润的细胞增多，较银屑病KC组，银屑病KC抑制miR-378组炎症减轻，表皮厚度变薄。分离皮损标本真表皮后，提取真皮内细胞通过流式细胞术检测DC特征性分子的表达发现较正常KC组，银屑病KC组和正常KC过表达miR-378组CD80、CD86、MHCII表达增加，较银屑病KC组，银屑病KC抑制miR-378组CD80、CD86、MHCII表达降低。<br>　　结论：<br>　　1、细胞因子处理和未处理HaCaT角质形成细胞培养上清中外泌体分泌量无明显差异，<br>　　分别与未成熟树突状细胞共孵育后，细胞因子处理HaCaT角质形成细胞来源外泌体组的树突状细胞表面共刺激分子表达增加，且上清中细胞因子IL-12、IL-23表达增加。<br>　　2、细胞因子处理模仿银屑病状态的角质形成细胞高表达miRNA-378，WB结果提示细胞因子处理组的树突状细胞中miR-378下游基因RORA水平显著下降，而过表达miR-378可以降低RORA的表达水平，抑制miR-378后RORA表达水平上升。<br>　　3、银屑病模型小鼠角质形成细胞来源外泌体加重小鼠耳银屑病皮损的炎症（红斑鳞屑、皮肤增厚），并促进真皮中DC细胞表面分子表达，而抑制银屑病模型小鼠角质形成细胞中的miR-378后炎症较之减轻。过表达正常小鼠角质形成细胞中的miR-378后炎症较注射了正常小鼠角质形成细胞来源外泌体的炎症加重。