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摘要食管鳞癌（esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）是食管癌最常见的亚型，在我国，豫北地区以及潮汕地区是两个食管癌发病率较高的地区。食管鳞癌早期的症状不明显，病人在确诊时疾病往往已是中晚期，食管鳞癌的5年生存率仅为15%-25%，因此早期诊断能够帮助食管鳞癌病人有较好的预后。基于潮汕地区食管鳞癌相较于其它地区有着较高的发病率，项目组前期发现PCDH9在非典型增生和浸润癌组织中存在DNA变异，其中拷贝数缺失比例较高。正常食管鳞状上皮发展为侵袭性浸润癌过程中，PCDH9蛋白表达强度下降，且初步细胞功能实验提示PCDH9基因可能影响细胞的增殖、侵袭和迁移。PCDH9是原钙粘蛋白（Protocadherin，PCDH）家族中的一员，可以编码蛋白大小约137KD，可以通过亲水相互作用增强细胞间的黏附作用。最近的研究报道中，PCDH9在胃癌，胶质瘤，肝细胞癌等中表达下调，且下调的程度与肿瘤组织学等级呈负相关。有关PCDH9在肿瘤发生发展中的具体机制目前仍然位于探索阶段，且其在食管鳞癌中起到何种作用目前还未见文献报道。<br>　　目的：<br>　　为了进一步明确在食管鳞癌癌变过程中PCDH9所起的作用，本研究对CRISPR-CAS9敲除PCDH9基因前后的食管癌细胞及食管永生化细胞进行凋亡和细胞周期的检测，并在敲除基础上构建过表达细胞模型进行相应的细胞功能实验，以证实PCDH9基因对食管细胞增殖、迁移、侵袭、克隆形成能力的作用。目前，对于PCDH9基在食管癌中的作用机制还未有深入研究，本研究首次通过转录组测序与蛋白测序联合分析，筛选PCDH9敲除前后的差异表达基因及蛋白，并对重要的差异表达基因及蛋白进行验证，寻找食管鳞癌癌变中PCDH9介导的相关信号通路。本研究初步证实PCDH9在食管鳞癌发展中过程中起到了抑癌的作用，力争继续探索PCDH9在食管鳞癌发生发展中的生物学重要性，为食管癌早期诊断提供理论基础。<br>　　方法：<br>　　材料<br>　　1.组织样本：课题组前期收集来自汕头大学医学院附属肿瘤医院病理科69例ESCC患者未经放化疗的手术后标本，术后标本均经临床病理医生确诊为食管癌。分别取癌、癌旁黏膜、远端切缘黏膜组织，根据组织病理分型，分为正常上皮（66例），单纯增生（66例），上皮内瘤变（68例），食管鳞癌（69例），共计组织样本269例。<br>　　2.细胞样本：NE6食管永生化细胞系由香港大学曹世华教授馈赠，KYSE150，KYSE520由上海吉凯基因化学技术有限公司馈赠。<br>　　方法<br>　　1.PCDH9基因在食管癌变过程中的作用：通过流式细胞术分析敲除细胞模型细胞凋亡的发生以及细胞周期的变化；对于敲除后过表达细胞模型，使用CCK-8法检测细胞的增殖能力变化、平板克隆实验分析细胞克隆形成能力、Transwell和划痕愈合实验分析肿瘤细胞侵袭迁移能力。<br>　　2.转录组测序：对PCDH9敲除前后的食管鳞癌细胞系KYSE520以及永生化细胞系NE6共12个样本进行了RNA测序文库构建，随后在Illumina平台上测序，筛选差异表达基因，并对其进行功能与通路富集。<br>　　3.蛋白组测序：对PCDH9敲除前后食管鳞癌细胞系KYSE520与食管永生化细胞系NE6共12个样本进行蛋白质组鉴定，采用4D-lable-free平台进行蛋白定量，筛选出差异表达蛋白，并对其进行功能、通路富集以及蛋白互作网络分析。<br>　　4.通过RNA与蛋白联合分析得出了显著差异基因和蛋白富集的信号通路，在细胞与癌变组织水平对筛选出的显著差异蛋白表达进行分析。蛋白印迹法与免疫组化染色用来检测关键差异蛋白的表达。<br>　　结果：<br>　　1.PCDH9基因在食管癌变过程中的作用：PCDH9基因缺失抑制食管癌细胞系KYSE150、KYSE520的细胞凋亡，而促进食管永生化细胞系NE6的凋亡（P＜0.05）。在食管癌细胞系中PCDH9敲除导致细胞出现了G2/M期阻滞，KYSE150G2/M期细胞的百分比从11.82%增加到21.19%，在KYSE520G2/M期则从10.51%上升到22.55%，相比之下，在NE6细胞中，PCDH9敲除导致了G0/G1期阻滞，G0/G1期的百分比从48.93%增加到71.71%。PCDH9过表达会导致食管鳞癌细胞克隆形成率减少，迁移侵袭能力减弱，而PCDH9过表达的永生化细胞系其生物学行为改变则恰恰相反。<br>　　2.转录组测序分析结果：根据|log2(FoldChange)|＞0且Padj＜0.05的标准筛选显著差异基因，在KYSE520中共筛选到433个基因，其中上调基因232个，下调基因201个，在NE6中共筛选到442个基因，其中上调基因263个，下调基因179个。GO功能富集显示KYSE520和NE6中差异表达基因涉及细胞迁移、粘附、分化以及多个与炎症相关的生物过程。KEGG通路富集显示NE6与KYSE520的差异基因均能富集于TNF信号通路，其中在NE6中显著富集，同时两个细胞系都富集到NF-kappa B信号通路。<br>　　3.蛋白组测序分析结果：根据|log2(FoldChange)|＞1且P value＜0.05的标准筛选显著差异蛋白，在KYSE520中共筛选到75个蛋白，上、下调蛋白数分别为22个和53个，在NE6中共筛选到339个蛋白，上、下调蛋白数分别为234个和105个。GO功能分析结果表明KYSE520与NE6差异表达蛋白富集具有一定的差异。KEGG通路富集结果表明KYSE520与NE6中均出现了NF-kappa B信号通路的改变，提示了PCDH9的缺失可能对该通路产生影响。<br>　　4.联合分析及验证结果<br>　　（1）在转录组测序以及蛋白组测序的联合分析中，TNF/NF-kappa B通路在转录和蛋白水平上都发生了改变，通路上的TRAF2与TRAF6也发生变化，NE6敲除组与对照组相比，TRAF2的mRNA与蛋白水平均显著升高，TRAF6的蛋白水平显著升高。在细胞模型中验证PCDH9敲除与过表达可以影响TRAF2、TRAF6表达水平的改变。<br>　　（2）TRAF2在67例不完全配对的食管正常上皮（N），单纯增生（H），上皮内瘤变（IEN），食管鳞癌（T）组织样本中，阳性率分别为10.77％（7/65）、21.54％（14/65）、84.62％（55/65）、98.44％（63/64）；TRAF6在69例不完全配对的食管癌变四个阶段组织样本中，阳性率分别为22.73%（15/66）、42.42%（28/66）、79.41%（54/68）、85.51%（59/69）。<br>　　（3）TRAF2蛋白表达强度与癌变进程呈正相关（rs=0.771，P＜0.001)，两两比较发现T-N、T-H、T-IEN及IEN-N、IEN-H均有显著差异（P＜0.001）；TRAF6蛋白表达强度与癌变进程呈正相关（rs=0.613，P＜0.001)，两两比较发现T-N、T-H、T-IEN、IEN-N、IEN-H及H-N均有显著差异（P＜0.05）。<br>　　（4）癌变不同阶段组织中TRAF2表达程度与PCDH9表达程度呈负相关（rs=-0.678，P＜0.001），TRAF6表达程度与PCDH9表达程度呈负相关（rs=-0.554，P＜0.001）。<br>　　结论：<br>　　1.体外实验证实PCDH9在食管癌细胞中起到了抑癌基因的作用，参与了细胞克隆形成、迁移、侵袭、细胞凋亡与细胞周期调控，且在正常细胞与肿瘤细胞中发挥了不同的生物学功能。<br>　　2.PCDH9敲除细胞模型的转录组与蛋白组多组学分析提示，TNF/NF-kappa B通路在转录和蛋白水平上都发生了改变。PCDH9可能通过TRAF2和TRAF6的表达参与了食管癌变过程中TNF/NF-kappa B信号通路的调节。