检索历史 清除

摘要小细胞肺癌（SCLC）是发生于呼吸系统的严重致命性亚型肺部肿瘤，侵袭程度高，倾向于早期发生转移和复发，导致患者在初始治疗阶段出现药物抗性，同时可选择的治疗方案较少，患者的预后状况不容乐观。肿瘤的发生及进展是错综复杂的因素综合作用的结果，常伴随细胞内分子的异常改变。其中，核有丝分裂器蛋白（NuMA）是细胞内一个关键的结构枢纽蛋白，通过自我组装成高度有序的结构，维持纺锤体结构的稳定，并参与细胞核的形成，通过与Leu-Gly-Asn（LGN）蛋白家族和dynein-dynactin结合形成dynein-dynactin-NuMA复合物参与细胞的有丝分裂过程。NuMA异常表达时，可以促进细胞形成多级纺锤体，使得染色体结构和分配发生紊乱，导致细胞不均等分裂或产生多个细胞核，从而使细胞发生死亡或诱导细胞恶性增殖，成为细胞癌变的重要一环。细胞分裂异常是肿瘤的主要呈现方式，因此，NuMA可能是肿瘤发病机制中的重要分子之一。<br>　　目的：<br>　　本研究旨在通过实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）和蛋白质免疫印迹法（Western Blot）确定NuMA在SCLC细胞系中的表达水平，构建sh-NuMA慢病毒载体以敲降NuMA基因，探索NuMA表达降低后，对SCLC NCI-H446细胞增殖、克隆、迁移、侵袭和凋亡等恶性生物学行为的调控作用，为NuMA在SCLC的形成和进展中所起的作用提供新的理论依据。<br>　　方法：<br>　　（1）利用qRT-PCR检测SCLC细胞系内NuMA mRNA的扩增情况；<br>　　（2）利用Western Blot检测SCLC细胞系内NuMA蛋白的表达水平；<br>　　（3）利用qRT-PCR和Western Blot验证NuMA的敲降效果，判断NuMA敲降的实验细胞模型是否构建成功；<br>　　（4）通过sh-NuMA慢病毒转染NCI-H446细胞，观察敲降NuMA对细胞形态的影响；<br>　　（5）实施CCK8增殖活力实验分析敲降NuMA对NCI-H446细胞体外增殖能力的影响；<br>　　（6）通过克隆形成实验观察敲降NuMA对NCI-H446细胞体外克隆成团能力的影响；<br>　　（7）利用划痕愈合实验和Transwell迁移实验分析敲降NuMA对NCI-H446细胞迁移能力的影响；<br>　　（8）通过Matrigel胶Transwell侵袭实验观察敲降NuMA对NCI-H446细胞侵袭能力的影响；<br>　　（9）采取Annexin V-FITC/PI法验证敲降NuMA后，NCI-H446细胞凋亡的改变情况。<br>　　结果：<br>　　（1）根据qRT-PCR和Western Blot实验结果发现，NuMA mRNA和蛋白的水平在NCI-H446和NCI-H69细胞中升高；<br>　　（2）用sh-NuMA慢病毒转染NCI-H446细胞后，未见细胞形态的显著改变；<br>　　（3）NuMA敲降后，实验组NCI-H446细胞的增殖和集落形成能力均低于sh-NC对照组，说明增殖能力受到显著抑制（P＜0.001）；<br>　　（4）经过划痕愈合与Transwell迁移实验发现，敲降NuMA后，NCI-H446细胞在横向（P＜0.01）和纵向（P＜0.05）的迁移能力均受到了影响；<br>　　（5）Matrigel胶侵袭实验结果显示，与sh-NC对照组细胞相比，NuMA敲降后实验组NCI-H446细胞的侵袭能力显著受到抑制（P＜0.001）；<br>　　（6）通过细胞凋亡实验发现NuMA敲降后，实验组NCI-H446的凋亡率较sh-NC对照组细胞高，差异明显有统计学意义(P＜0.01)。<br>　　结论：<br>　　（1）本研究证实了NuMA在SCLC NCI-H446和NCI-H69细胞中高表达；<br>　　（2）本研究从细胞水平探索了NuMA敲降后对SCLC NCI-H446细胞恶性生物学行为的影响。NuMA敲降后可显著抑制NCI-H446细胞的增殖、克隆、迁移和侵袭行为，且诱导细胞凋亡，为SCLC的发病机制提供新的研究渠道。