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摘要第一部分：天竺葵素在体外对小鼠软骨细胞炎症和表型的影响及其机制的研究<br>　　目的：<br>　　骨关节炎是中老年人常见的疾病，主要临床表现为关节畸形、疼痛和功能障碍，其发病与软骨细胞外基质的破坏和炎症反应息息相关。炎症和炎症反应是引发和加剧骨关节炎发生发展的关键因素,在这些炎症因子中，白细胞介素-1β（Interleukin-1β,IL-1β）被认为在骨关节炎的病理发展中起到关键作用。核转录因子κB（NF-κB）是一种二聚体转录因子，起到协调多种生理和病理过程的作用，特别是炎症的发生与发展。天竺葵素（Pelargonidin，PG）属于花青素的一种，是一种天然存在于植物中的化合物，它已被证实在某些疾病中具有抗氧化和抗炎作用。但是，天竺葵素对骨关节炎的作用还未被证明，其具体的作用机制还有待深入研究。本部分旨在探讨天竺葵素对于IL-1β诱导的小鼠软骨细胞炎症反应的作用及其机制。<br>　　方法：<br>　　1.C57BL/6J原代软骨细胞的分离、培养及冻存。<br>　　2.利用细胞计数试剂盒-8（cellcountingKit-8，CCK-8）法检测PG和IL-1β（10ng/ml）对小鼠软骨细胞活性影响。<br>　　3.利用逆转录-聚合酶链式反应（ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction，RT-PCR）检测浓度梯度的PG作用于由IL-1β（10ng/ml）刺激的小鼠软骨细胞后一氧化氮合酶（Induciblenitricoxidesynthase,iNOS）、环氧化酶-2（Cyclooxygenase-2,COX-2）、白细胞介素-6（Interleukin-6,IL-6）和肿瘤坏死因子-α（Tumornecrosisifactor-α,TNF-α）基因水平的表达。<br>　　4.利用软骨细胞高密度培养和甲苯胺蓝染色观察小鼠软骨细胞经IL-1β（10ng/ml）刺激后加入浓度梯度的PG，软骨细胞外基质的形态及染色后的情况。<br>　　5.利用免疫荧光实验观察浓度梯度的PG作用于由IL-1β（10ng/ml）刺激的小鼠软骨细胞后Ⅱ型胶原蛋白（CollagenⅡ，COLⅡ）的荧光强度。<br>　　6.利用免疫印迹试验（Western-blotting,WB）测定浓度梯度的PG作用于由IL-1β（10ng/ml）刺激的小鼠软骨细胞后基质金属蛋白酶13（Matrixmetalloproteinase13,MMP13）、蛋白聚糖酶5（Adisintegrinandmetalloproteinasewiththrombospondinmotifs5,ADAMTS5）、COLⅡ、iNOS和COX-2在蛋白水平的表达。<br>　　7.利用免疫印迹试验和免疫荧光实验观察浓度梯度的PG作用于由IL-1β（10ng/ml）刺激的小鼠软骨细胞后p65的核转位情况。<br>　　结果：<br>　　1.在0-40μM的浓度范围内天竺葵素对小鼠软骨细胞的活性没有影响，当浓度升高到80μM及更高时，出现了明显的毒性作用。<br>　　2.在基因层面上单独加入IL-1β（10ng/ml）会促进软骨细胞内炎症介质如IL-6、TNF-α、COX-2、iNOS的表达，而加入PG后IL-6、TNF-α、COX-2、iNOS的表达明显下降，且抑制作用随PG浓度的增加而增强。<br>　　3.IL-1β（10ng/ml）单独作用于软骨细胞时，甲苯胺蓝染色结果十分浅，随着PG的加入，软骨细胞染色变深，且加深的程度与PG的浓度正相关。<br>　　4.单独用IL-1β（10ng/ml）处理的软骨细胞COLⅡ荧光强度很弱，而用天竺葵素和IL-1β共同处理的实验组COLⅡ荧光强度逐渐增强，并与PG的浓度有关。<br>　　5.PG在蛋白水平下调由IL-1β（10ng/ml）刺激引起的MMP13、ADAMTS5、iNOS和COX-2的升高，并且抑制IL-1β（10ng/ml）造成的COLⅡ的分解，呈浓度依赖性。<br>　　6.在IL-1β（10ng/ml）的刺激下，绝大部分p65发生核转位，但是在用PG与IL-1β共同刺激后，p65核转位情况显著减少。<br>　　结论：<br>　　PG可以通过抑制NF-κB通路的激活减弱小鼠软骨细胞经IL-1β（10ng/ml）刺激后产生的炎性反应并对软骨细胞表型有维持作用。<br>　　第二部分：天竺葵素在体内对小鼠骨关节炎模型作用的研究<br>　　目的：<br>　　骨关节炎是一种以软骨破坏，软骨下骨增厚，骨赘形成及不同程度的滑膜炎并关节囊增厚为特点的关节疾病，在这部分我们拟采用小鼠内侧半月板-胫骨韧带切除术（Destabilizationofthemedialmeniscus，DMM）构建实验性关节炎模型，在体内水平探究PG对骨关节炎小鼠模型关节退变的保护作用及其机制。<br>　　方法：<br>　　1.通过小鼠内侧半月板-胫骨韧带切除术（DMM术）构建实验性骨关节炎模型，口服给药方式给与小鼠PG，8周后处死取膝关节标本制成石蜡切片。<br>　　2.将石蜡切片进行番红固绿（SafraninO,SO）染色和苏木素伊红（Hematoxylinandeosin,HE）染色。<br>　　3.利用免疫组织化学染色将石蜡切片进行染色，分析关节软骨细胞Aggrecan、MMP13的阳性表达量。<br>　　结果：<br>　　1.经番红固绿染色和苏木素伊红染色可见DMM组的软骨表面较PG实验组更加粗糙不平，严重的地方有软骨面的缺损。给与PG的实验组软骨表面较DMM组有明显的改善，且软骨表面光滑平整程度和PG的浓度呈依赖性。<br>　　2.经免疫组化染色可见PG实验组较DMM组的软骨细胞中Aggrecan的阳性表达量更多，而MMP13的阳性表达量则更少。<br>　　结论：<br>　　PG可以缓解由内侧半月板-胫骨韧带切除术（DMM术）构建实验性骨关节炎模型小鼠的膝关节软骨退变，并维持关节软骨细胞外基质的代谢稳态。