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基于NF-κB信号通路探究天竺葵素对骨关节炎的作用及机制

摘要第一部分:天竺葵素在体外对小鼠软骨细胞炎症和表型的影响及其机制的研究<br>  目的:<br>  骨关节炎是中老年人常见的疾病,主要临床表现为关节畸形、疼痛和功能障碍,其发病与软骨细胞外基质的破坏和炎症反应息息相关。炎症和炎症反应是引发和加剧骨关节炎发生发展的关键因素,在这些炎症因子中,白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)被认为在骨关节炎的病理发展中起到关键作用。核转录因子κB(NF-κB)是一种二聚体转录因子,起到协调多种生理和病理过程的作用,特别是炎症的发生与发展。天竺葵素(Pelargonidin,PG)属于花青素的一种,是一种天然存在于植物中的化合物,它已被证实在某些疾病中具有抗氧化和抗炎作用。但是,天竺葵素对骨关节炎的作用还未被证明,其具体的作用机制还有待深入研究。本部分旨在探讨天竺葵素对于IL-1β诱导的小鼠软骨细胞炎症反应的作用及其机制。<br>  方法:<br>  1.C57BL/6J原代软骨细胞的分离、培养及冻存。<br>  2.利用细胞计数试剂盒-8(cellcountingKit-8,CCK-8)法检测PG和IL-1β(10ng/ml)对小鼠软骨细胞活性影响。<br>  3.利用逆转录-聚合酶链式反应(ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction,RT-PCR)检测浓度梯度的PG作用于由IL-1β(10ng/ml)刺激的小鼠软骨细胞后一氧化氮合酶(Induciblenitricoxidesynthase,iNOS)、环氧化酶-2(Cyclooxygenase-2,COX-2)、白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)和肿瘤坏死因子-α(Tumornecrosisifactor-α,TNF-α)基因水平的表达。<br>  4.利用软骨细胞高密度培养和甲苯胺蓝染色观察小鼠软骨细胞经IL-1β(10ng/ml)刺激后加入浓度梯度的PG,软骨细胞外基质的形态及染色后的情况。<br>  5.利用免疫荧光实验观察浓度梯度的PG作用于由IL-1β(10ng/ml)刺激的小鼠软骨细胞后Ⅱ型胶原蛋白(CollagenⅡ,COLⅡ)的荧光强度。<br>  6.利用免疫印迹试验(Western-blotting,WB)测定浓度梯度的PG作用于由IL-1β(10ng/ml)刺激的小鼠软骨细胞后基质金属蛋白酶13(Matrixmetalloproteinase13,MMP13)、蛋白聚糖酶5(Adisintegrinandmetalloproteinasewiththrombospondinmotifs5,ADAMTS5)、COLⅡ、iNOS和COX-2在蛋白水平的表达。<br>  7.利用免疫印迹试验和免疫荧光实验观察浓度梯度的PG作用于由IL-1β(10ng/ml)刺激的小鼠软骨细胞后p65的核转位情况。<br>  结果:<br>  1.在0-40μM的浓度范围内天竺葵素对小鼠软骨细胞的活性没有影响,当浓度升高到80μM及更高时,出现了明显的毒性作用。<br>  2.在基因层面上单独加入IL-1β(10ng/ml)会促进软骨细胞内炎症介质如IL-6、TNF-α、COX-2、iNOS的表达,而加入PG后IL-6、TNF-α、COX-2、iNOS的表达明显下降,且抑制作用随PG浓度的增加而增强。<br>  3.IL-1β(10ng/ml)单独作用于软骨细胞时,甲苯胺蓝染色结果十分浅,随着PG的加入,软骨细胞染色变深,且加深的程度与PG的浓度正相关。<br>  4.单独用IL-1β(10ng/ml)处理的软骨细胞COLⅡ荧光强度很弱,而用天竺葵素和IL-1β共同处理的实验组COLⅡ荧光强度逐渐增强,并与PG的浓度有关。<br>  5.PG在蛋白水平下调由IL-1β(10ng/ml)刺激引起的MMP13、ADAMTS5、iNOS和COX-2的升高,并且抑制IL-1β(10ng/ml)造成的COLⅡ的分解,呈浓度依赖性。<br>  6.在IL-1β(10ng/ml)的刺激下,绝大部分p65发生核转位,但是在用PG与IL-1β共同刺激后,p65核转位情况显著减少。<br>  结论:<br>  PG可以通过抑制NF-κB通路的激活减弱小鼠软骨细胞经IL-1β(10ng/ml)刺激后产生的炎性反应并对软骨细胞表型有维持作用。<br>  第二部分:天竺葵素在体内对小鼠骨关节炎模型作用的研究<br>  目的:<br>  骨关节炎是一种以软骨破坏,软骨下骨增厚,骨赘形成及不同程度的滑膜炎并关节囊增厚为特点的关节疾病,在这部分我们拟采用小鼠内侧半月板-胫骨韧带切除术(Destabilizationofthemedialmeniscus,DMM)构建实验性关节炎模型,在体内水平探究PG对骨关节炎小鼠模型关节退变的保护作用及其机制。<br>  方法:<br>  1.通过小鼠内侧半月板-胫骨韧带切除术(DMM术)构建实验性骨关节炎模型,口服给药方式给与小鼠PG,8周后处死取膝关节标本制成石蜡切片。<br>  2.将石蜡切片进行番红固绿(SafraninO,SO)染色和苏木素伊红(Hematoxylinandeosin,HE)染色。<br>  3.利用免疫组织化学染色将石蜡切片进行染色,分析关节软骨细胞Aggrecan、MMP13的阳性表达量。<br>  结果:<br>  1.经番红固绿染色和苏木素伊红染色可见DMM组的软骨表面较PG实验组更加粗糙不平,严重的地方有软骨面的缺损。给与PG的实验组软骨表面较DMM组有明显的改善,且软骨表面光滑平整程度和PG的浓度呈依赖性。<br>  2.经免疫组化染色可见PG实验组较DMM组的软骨细胞中Aggrecan的阳性表达量更多,而MMP13的阳性表达量则更少。<br>  结论:<br>  PG可以缓解由内侧半月板-胫骨韧带切除术(DMM术)构建实验性骨关节炎模型小鼠的膝关节软骨退变,并维持关节软骨细胞外基质的代谢稳态。

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导师 戴闽
学位信息:
南昌大学医学部 临床医学 外科学(骨外)(硕士) 2022年
分类号 R684.3
发布时间 2022-11-14
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