检索历史 清除

摘要目的：<br>　　分别从体外细胞实验和体内动物实验两个方面探索青蒿素的半合成衍生物青蒿琥酯(Artesunate，简称ART)对骨性关节炎(osteoarthritis，简称OA)的影响作用，并初步探究其作用机制，以期为骨性关节炎的治疗提供新的思路。<br>　　方法：<br>　　1.体外细胞实验探索：从体外细胞系中研究ART对小鼠骨性关节炎体的作用及其具体的作用机制。从对骨性关节炎最新的研究进展可知，早期骨性关节炎发展过程中最重要的过程为软骨细胞丢失增加和破骨细胞的活化导致的软骨下骨重建增加，所以本研究主要从ART对软骨细胞炎症反应过程和破骨细胞形成的影响两方面来探究其对骨性关节炎的作用。<br>　　①软骨：首先，在软骨细胞前体细胞系ATDC5细胞中，在白细胞介素-1β(IL-1β)作用下模拟OA发展过程中软骨细胞的炎症环境，利用CCK-8方法确定ART作用于ATDC5细胞24、48、72小时的安全作用浓度范围；然后，在ART对ATDC5细胞的安全作用浓度范围内，选择不同浓度的ART，研究其对软骨细胞炎症过程的影响，是否对细胞表观形态有所改变。<br>　　②软骨下骨：同样先利用CCK-8实验，确定ART作用于BMMs细胞的安全浓度范围；使前体细胞BMMs在细胞因子M-CSF和RANK的刺激下向破骨细胞分化，在分化过程中，不同浓度的ART作用于BMMs细胞，以探究其对BMMs向破骨细胞分化过程的影响作用。<br>　　2.体内动物实验证实：在细胞表型实验的基础上，再次从体内动物实验方面证实ART对小鼠骨性关节炎的影响作用。<br>　　首先，将40只8周龄的C57B6/L小鼠随机分为4组：Sham(假手术组)、Vehicle(对照组)、Low ART(低剂量药物组)和High ART(高剂量药物组)。后3组通过手术诱导右下肢膝关节内侧半月板不稳定，以建立小鼠DMM骨性关节炎模型，第1组为假手术组，只进行右下肢膝关节的关节囊切开缝合。术后次日起给予药物干预，根据小鼠体重，低剂量组腹腔注射10mg/kg的ART，高剂量组腹腔注射50mg/kg的ART，假手术组和对照组腹腔注射等量生理盐水，隔日给药一次。药物分组处理4周后，从每组10只小鼠中随机处死6只，获取其右下肢的完整膝关节标本，包括两端的股骨及胫骨，经石蜡固定切片后，利用组织HE(苏木精伊红)染色、Safranin O(番红固绿)染色及破骨细胞特异性抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate resisrant acid phosphatase，TRAP)染色方法，观察不同分组间小鼠膝关节软骨的破坏程度及软骨下骨重建的程度，以明确ART对小鼠DMM骨关节炎模型导致的骨性关节炎的影响作用。<br>　　3.蛋白分子层面阐明机制：本部分研究将利用蛋白免疫印迹法(Weastern Blot)，从蛋白表达层面探讨ART抑制软骨细胞炎症反应和抑制破骨细胞形成可能的途径及其分子机制。对于IL-1β介导的软骨细胞炎症反应激活的信号转导通路，探究ART是否具有作用，具有何种作用，同样，RANKL诱导破骨分化过程激活的主要通路，探究不同浓度的ART对哪些通路的激活具有作用，具有何种作用。<br>　　结果：<br>　　1.体外细胞实验：①CCK-8实验结果示：在10ng/ml的IL-1β环境下，ART浓度＞10μM时，对ATDC5细胞产生明显的毒性作用；而ART浓度＞20μM时，对BMMs细胞产生明显的细胞毒性；②ART可明显抑制IL-1β介导的软骨细胞炎症反应，且呈浓度依赖性；ART能明显抑制RANKL诱导的破骨细胞形成，且浓度依赖性。<br>　　2.体内动物实验：ART可以减轻软骨及软骨下骨破坏。相比假手术组，对照组小鼠膝关节的软骨和软骨下骨呈现明显破坏，而经ART治疗后关节破坏明显减轻，高剂量组减轻更为明显。<br>　　3.相关机制：ART通过抑制MAPK(p38)信号通路抑制IL-1β诱导的MMP-13合成，从而减轻软骨炎症反应；ART通过抑制MAPK(JNK)、PI3K/AKT信号通路来抑制RANKL诱导的破骨细胞的形成。<br>　　结论：<br>　　ART通过抑制MAPK(p38)途径抑制IL-1β介导的MMP-13的合成从而减轻软骨破坏，同时还通过抑制MAPK(JNK)、PI3K/AKT途径抑制RANKL诱导的破骨细胞形成，从而从减轻软骨破坏及抑制软骨下骨重建两个方面减缓小鼠DMM模型导致的骨性关节炎。