检索历史 清除

摘要目的：<br>　　肝移植是治疗终末期肝病唯一有效的方法。然而，移植供体器官极度的短缺导致许多病人在等待肝移植治疗的过程中死亡。为了缓解移植器官短缺的问题，心脏死亡供体(Donation after cardiac death,DCD)肝脏捐献的使用率有所增加。然而，与脑死亡供体（Donation after brain death，DBD)肝脏相比，DCD肝脏移植在恢复过程中，额外的原位热缺血时间增加了受者发生移植物相关并发症的风险，导致预后较差，且DCD供肝对传统的静态冷储（Static cold storage,SCS）耐受性较差。低温携氧机械灌注（Hypothermic oxygenated perfusion，HOPE）是近年来兴起的一种新型器官保存方式，其在减轻DCD供肝缺血再灌注损伤（Ischemia-reperfusion injury,IRI）中的作用已得到越来越多的认可。然而，HOPE调节DCD肝移植过程中肝IRI的具体分子机制仍不清楚。嘌呤能信号信号通路与肝脏疾病密切相关，参与了肝脏炎症反应、IRI、移植术后排斥反应等病理生理过程。CD39是一种细胞表面外核苷酶，在调节嘌呤能信号转导中起关键作用，它可以将胞外ATP和ADP分解为AMP,后者被CD73转化为腺苷，并与细胞外腺苷受体结合，起到抗炎和组织保护作用。A2B是最不敏感的腺苷受体，只有在缺氧或缺血等病理条件下发挥作用。在本研究中，探究了HOPE对DCD肝脏的具体保护作用，以及探讨其机制是否为调节CD39-腺苷-A2B信号通路。<br>　　方法：<br>　　建立大鼠DCD肝脏模型，搭建HOPE灌注系统和大鼠肝脏体外灌注系统，以模拟临床DCD肝移植过程。通过检测灌注液AST、ALT和TM水平、肝组织Hamp;E染色和CD31免疫荧光化学染色（IF）评估肝脏损伤；通过检测肝组织MDA和SOD含量和ROS染色来评估氧化应激损伤；通过检测肝组织IL-6和TNF-α的含量和MPO和CD68免疫组织化学染色（IHC）来评估炎症反应；通过检测肝组织凋亡相关蛋白（Bax,Bcl-2和Caspase3）和TUNEL染色来评估细胞凋亡程度；通过高效液相色谱法(High performance liquid chromatogr aphy，HPLC)测定肝组织中腺苷的含量；通过Western blot和qT-PCR检测CD39、CD73、A1、A2A、A2B、A3的表达情况；通过免疫荧光双标记共染色以探讨CD39和A2B在肝脏细胞中表达分布情况；构建腺相关病毒8(Adeno-associated virus8，AAV8)并进行大鼠体内转染，正反调控CD39的表达；使用PSB1115药物抑制A2B的表达；最后，收集4对临床肝移植标本，对其进行组织Hamp;E染色和CD31IHC，同时检测组织CD39和A2B的表达情况。<br>　　结果：<br>　　与CS相比，HOPE可以降低大鼠DCD供肝灌注液中AST、ALT和TM的水平,减轻肝细胞坏死和空泡化、肝窦间淤血和肝窦内皮损伤；HOPE可减少大鼠DCD肝组织中MDA和ROS的含量，增加SOD的水平，减轻氧化应激损伤；HOPE可减少组织中促炎细胞因子TNF-α和IL-6的水平，减少组织中性粒细胞和巨噬细胞浸润，减轻大鼠DCD肝脏炎症反应；HOPE可抑制促凋亡蛋白Bax的表达和Caspase3的激活，而促进抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，减少TUNEL-阳性细胞的数量，减轻大鼠DCD肝脏细胞凋亡；HOPE可促进CD39、CD73和A2B的表达和腺苷的生成，且CD39主要表达于肝窦内皮细胞，而A2B主要表达于肝细胞；AAV8可有效的抑制或促进CD39的表达，促进CD39的表达可加强HOPE对大鼠DCD供肝的保护作用，而抑制CD39的表达可弱化HOPE对大鼠DCD肝脏的保护作用；药物阻断A2B表达可消除HOPE中过表达CD39减轻大鼠DCD肝脏损伤的作用；临床肝移植标本经历IRI后肝细胞和肝窦内皮细胞均出现损伤，且IRI可促进组织中CD39和A2B的表达。<br>　　结论：<br>　　HOPE可抑制大鼠DCD肝脏IR诱导的氧化应激、炎症反应和细胞凋亡，从而减轻DCD肝脏损伤；机制上，HOPE可促进DCD肝脏肝窦内皮细胞上CD39的表达，促进腺苷的生成，然后激活肝细胞上腺苷A2B受体，抑制由IR引起的氧化应激、炎症反应及细胞坏死和凋亡，对大鼠DCD肝脏发挥保护作用；在临床肝移植中，IRI可诱导肝窦内皮细胞和肝细胞损伤，同时可促进CD39和A2B的表达。