检索历史 清除

摘要目的：<br>　　目前，经FDA批准的嵌合抗原受体T细胞疗法主要运用于血液肿瘤疾病，正在进行的CAR-T临床试验也集中于血液肿瘤；其中，CD19依然是最受欢迎的抗原靶点。经CAR-T治疗的患者，仍可能因抗原逃逸导致疾病复发，优化其抗原识别域就极具意义：如应用分子量更小的抗原识别域构建双特异性CAR，进而获得高质量的CAR-T细胞，期望它能发挥更好的体内外肿瘤杀伤效应。<br>　　作为现发现最小且有抗原识别功能的单域抗体，与人抗体的重链可变区高度同源化的特点，吸引了众多研究者去探索它在CAR-T细胞中的应用是什么样的。本文初步探索使用单域抗体作为CAR结构中的抗原识别域，构建的CAR-T细胞具有肿瘤杀伤效应；以及串联两个识别相同抗原表位的单域抗体后，CAR-T细胞肿瘤杀伤效应有所提高。以此为基础，为后续筛选发现更优的单域抗体，从而构建双价或双特异性CAR提供参考。<br>　　方法：<br>　　第一章：基于sdAb构建的CAR-T细胞制备<br>　　1.采用第三代质粒系统，通过脂质体转染293T细胞的方式制备慢病毒；<br>　　2.通过羟乙基淀粉沉降红细胞，以获取CBNC；再通过CD4+和CD8+磁珠分选得到纯化的T细胞；<br>　　3.采用CRISPR/Cas9技术进行TCR和HLA-Ⅰ类分子的敲除；<br>　　4.流式细胞仪检测T细胞活化、慢病毒转导T细胞的转导率、以及CAR-T细胞体外扩增培养累计增殖倍数。<br>　　第二章：基于sdAb构建的CAR-T细胞的体外功能验证<br>　　1.使用Nalm6和Namalwa两种细胞系作为靶细胞，将效靶细胞按一定比例混合培养后，采用流式细胞仪检测CAR-T细胞的体外杀伤效率；采用荧光显微镜观察靶细胞数量是否减少，从而反应CAR-T细胞杀伤功能；<br>　　2.通过流式细胞仪检测经靶细胞刺激后，效应细胞CD107a的表达情况；<br>　　3.通过ELISA检测效靶细胞培养上清中细胞因子释放水平；<br>　　4.采用流式细胞仪检测体外培养的CAR-T细胞表型、以及耗竭水平；<br>　　5.通过Gator非标记生物分子分析仪测定sdAb的亲和力。<br>　　结果：<br>　　第一章：基于sdAb构建的CAR-T细胞制备<br>　　1.构建单/双价慢病毒原液滴度分别为4.9E6TU/ml，4.1E6TU/ml；<br>　　2.经羟乙基淀粉沉降分离获取的CBNC中T细胞可被anti-CD3/CD28单克隆抗体刺激活化；<br>　　3.T细胞上TCR和HLA-Ⅰ分子双敲除率为28.9%；<br>　　4.基于sdAb构建的单/双价CAR均成功转导脐带血T细胞，CD4+T细胞的转导效率达90%以上，CD8+T细胞的转导效率达70%以上；<br>　　5.构建的单/双价CAR，经慢病毒搭载转导T细胞后，其不影响CAR-T细胞体外扩增能力。<br>　　第二章：基于sdAb构建的CAR-T细胞的体外功能验证<br>　　1.串联两个识别相同抗原表位的单域抗体，以构建CAR-T细胞CD192×/Nb CAR，其肿瘤杀伤效应强于单价单域抗体的CAR-T细胞（CD191×/Nb CAR）。<br>　　2.CD192×/Nb CAR不影响T细胞的分化；但可能影响CD8+T细胞的耗竭。<br>　　结论：<br>　　采用脐带血作为T细胞来源，以单域抗体作为CAR结构中的抗原识别域，成功构建CAR-T细胞。构建的CAR-T细胞具有体外肿瘤杀伤效应，且串联两个单域抗体构建的CAR-T细胞肿瘤杀伤效应强于仅含一个单域抗体构建的CAR-T细胞。