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摘要研究背景与目的：<br>　　电化学发光（Electrochemiluminescence,ECL）是通过电极表面发生的氧化还原反应，在氧化还原产物自身之间或与其他共存物之间化学反应生成激发态，激发态跃迁回基态的过程中，产生的发光现象。当特定设计序列的核酸标记ECL信号分子形成探针后，通过碱基互补配对捕获探针，从而产生核酸定量检测ECL信号，由此构建ECL核酸传感器。ECL核酸传感器兼具核酸检测及ECL分析的优点，二者结合具有特异性强、选择性好、仪器设备简单、易于实现自动化等显著优势，为DNA检测领域提供了有力的研究手段与方法。<br>　　在构建新型ECL核酸检测平台过程中使用纳米银，可以有效增平台灵敏度实现核酸强超灵敏检测。目前已经报道银纳米材料（AgNPs）和量子点（QDs）有潜力催化电化学条件下过硫酸盐（S2O82-）向SO4??自由基的转化，从而增强S2O82-的阴极电化学发光信号。但同时探究其对过硫酸盐阴阳双极ECL信号影响的研究却鲜有报道。全球癌症统计表明，癌症死亡人数在逐年上升，其中临床表现滞后、缺乏早期诊断、预后耐药是癌症总体生存率较低的主要原因。一些新型生物标志物如非编码RNA是癌症早期诊断及预后的重要指标，因此建立一种高效、特异、灵敏的非编码RNA检测方法对癌症的筛查、诊断、治疗及预后具有重要意义。本论文构建的新型核酸检测平台融合了ECL技术，纳米催化技术，核酸技术的优点，具备高特异性和灵敏性有望实现临床肿瘤非编码RNA痕量检测。<br>　　材料与方法：<br>　　1.低温化学还原合成纳米银，以曲面响应法（SurfaceResponseMethod,RSM）探讨硼氢化钠浓度、硝酸银浓度、聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpyrrolidone,PVP）浓度和滴速，对纳米银粒径及其ECL信号的影响，以合成形貌可控、ECL信号最强的六边形AgNPs（H-AgNPs）。以高分辨透射电镜（HRTEM）、荧光光谱（FL）、紫外可见吸收光谱（UV-Vis）表征高分子聚合物PVP调控AgNPs纳米晶的光学性质及形态学特点。利用电子自旋共振谱（Electronparamagneticresonance,EPR）技术，探讨AgNPs结晶诱导共反应增强S2O82-阴极ECL信号的自由基机理。<br>　　2.以电聚合聚苯胺-氧化石墨烯（PANI-GO）为固相基底，通过层层自组装发卡型探针传感界面，以DNA聚集H-AgNPs结晶诱导增强ECL发光信号，实现肿瘤组织样本中的miRNA-221定量传感检测。并对ECL和实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测结果进行方法学对比，评价传感器性能。<br>　　3.以PANI-GO复合膜作为基底，motif序列作为识别元件，基于滚环扩增（Rollingcircleamplification,RCA）聚集AgNPs和ZnCdSe量子点标记的motif互补探针，诱导增强ECL信号，以阴阳双极ECL强度比值对长链非编码RNA（LncRNA）定量，构建比率型HOTAIRLncRNA超灵敏传感器。并就比率型ECL和qRT-PCR对肺癌组织样本中HOTAIR检测结果进行方法学对比，评价传感器性能。<br>　　结果：<br>　　1.RSM实验表明，硝酸银浓度（CAgNO3）是影响纳米银粒径（dAgNPs）和ECL信号强度（I）的主要因素，而硼氢化钠浓度、PVP浓度、滴速对粒径和ECL信号影响较小。以CAgNO3和dAgNPs为自变量，I为因变量的等高线图中发现，当合成的H-AgNPs粒径较小（70-120nm）或过大时（138-157nm），随着AgNO3浓度从0.4mM增加到4.0mM，ECL强度明显增加。当H-AgNPs粒径位于128nm到138nm的范围，在0.4mM＜CAgNO3＜2.25mM范围内，随着AgNO3浓度增加AgNPsECL信号急剧增加；在2.25mM＜CAgNO3＜4.0mM范围内，随着AgNO3浓度增加AgNPsECL信号略有下降，且硝酸银浓度为2.25mM时，合成的纳米银粒子的ECL强度达到最大，ECL强度表现出明显的CAgNO3浓度依赖关系。<br>　　2.实验探究H-AgNPs对S2O82?阴极ECL信号的影响，发现H-AgNPs对S2O82?-1.4V左右的ECL有明显增敏作用。EPR表征表明，H-AgNPs通过促进S2O82?的ECL反应过程中OH??的生成催化S2O82-阴极ECL发光。实验以H-AgNPs标记发卡探针构建miRNA-221传感器，基于DNA聚集H-AgNPs对基底S2O82?的共反应催化作用，建立ECL信号与目标待测物miRNA-221浓度的线性依赖关系。实验结果表明目标ECL核酸传感器对miRNA-221有较灵敏的分析表现，线性范围为7.47×107~3.74×1012copies/mL，检出限为7.47×103copies/mL(S/N=3)。实际样本检测结果表明，ECL核酸传感器与qRT-PCR的检测结果具有很好的一致性，表明该方法具有很好的应用前景。<br>　　3.实验通过MEME软件在线比对分析4个物种的6个HOTAIR参考序列，得到HOTAIRLncRNA的3个motif保守区段。以motif1为捕获区段固相固载RNA，滚环扩增motif2和motif3相邻区段后，再分别以H-AgNPs和ZnCdSe标记motif2和motif3的互补探针，结合于扩增链上，基于ZnCdSe与H-AgNPs聚集增强过硫酸盐阴阳双极电化学发光，构建比率型ECL传感器。该传感器线性范围为4×10-3~200ng/mL，检测下限低至1pg/L(S/N=3)。实际样本检测结果表明qRT-PCR的检测结果具有很好的一致性，表明该方法具有很好的应用前景。<br>　　结论：<br>　　1.通过响应面法成功合成了具有RIM特性的六边形纳米银材料（H-AgNPs），同时发现其对过硫酸盐阴极ECL信号促进能力很强。<br>　　2.新的固相共反应剂H-AgNPs，通过电化学氧化还原循环往复原位生成Ag+离子催化S2O82?水相还原生成OH??，从而增敏S2O82?的阴极ECL信号。采用H-AgNPs聚集诱导S2O82?的阴极ECL信号增强，构建核酸传感器检测组织样本中的miRNA-221。方法学对比结果表明，目标传感器具有很好的应用前景。<br>　　3.使用MEME软件对比分析4个物种的6个HOTAIR参考序列，得到HOTAIRLncRNA的3个motif保守区段。以3个motif保守区段互补探针聚集诱导增强过硫酸盐阴阳双极电化学发光，构建比率型ECL传感器检测组织样本中的HOTAIR。同时，目标传感器与荧光定量PCR法方法学对比结果表明，该方法具有很好的应用前景。