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摘要Oddi括约肌（Sphincter of Oddi，SO）主要由胆胰管及壶腹三部分括约肌组成，内含丰富的非横纹肌的肌肉组织纤维，受多种神经和激素的调控，其中较为重要的有发挥兴奋性作用的胆囊收缩素(Cholecystokinin,CCK)及发挥抑制性作用的一氧化氮（Nitric oxide,NO）。SO的作用相当于“阀门”和“阻力器”，不仅可调控胆囊的充盈、胆胰液的流速及流量、维持胆胰管压力，且可避免肠内容物反流入胆胰管以保持胆道和胰管相对无菌的状态，在胃肠系统具有重要的生理意义。因此，当SO的结构或功能发生异常时，胆胰液就可能会排出不畅甚至导致胆道痉挛，出现剧烈腹痛、黄疸等症状，该类疾病被命名为Oddi括约肌功能障碍（Sphincter of Oddi dysfunction,SOD），它是一种常见却难以明确诊断治疗的胆胰结合部疾病之一。现阶段，对于SOD的各方面研究仍均处于早期阶段，尚无特效药物或其他较好的治疗方式。芍药甘草汤（Shaoyao Gancao Decoction，SGD）源于2000年临床实践的《伤寒论》，其具有柔肝濡筋，缓解痉挛疼痛的功效。科学研究证实芍药甙（Paeoniflorin，PF）是白芍发挥药理作用的主成分，众多学者对SGD，PF进行了深入客观的研究，证实其可有效缓解消化、生殖等系统因肌肉痉挛引起的肌肉疼痛。SO属于胃肠消化系统的平滑肌，在中西医结合临床应用上，中国医生选用SGD治疗SOD疗效不错，但对于SGD治疗SOD发挥的潜在机制尚不清楚，还需科学研究者不懈的进行深入的研究。Cajal间质细胞（Interstitial Cells of Cajal,ICC），一种对胃肠道运动起重要调节作用的非神经间质细胞，在控制胃肠蠕动中起中心作用，其还被认为是肠神经系统（Enteric Nerve System,ENS）向平滑肌细胞（Smooth Muscle Cells,SMC）传递信号的信息整合中转枢纽。当前研究发现，胃肠道运动功能障碍疾病中，一部分原因是ICC数目异常或减少，或神经（ENS）-Cajal间质细胞（ICC）-平滑肌细胞（SMC）网络神经传递减少。目前对于ENS-ICC-SMC在SOD发病机制尚不清楚。因此，我们推测SGD和PF可能对SO中的ENS-ICC-SMC发挥作用，这需要有待进一步的研究探讨。<br>　　目的：<br>　　观察芍药甘草汤及芍药甙对高胆固醇血症兔中SO的ENS-ICC-SMC网络的影响并探讨对ICC的增殖能力的影响。<br>　　方法：<br>　　新西兰大耳兔32只，随机分为对照组（CON组）、模型组（HC组）、芍药甘草汤组（SGD组）、芍药甙组（PF组）（每组n=8）。CON组以标准家兔饲料喂养8w，其余三组均饲喂含1%的胆固醇标准家兔饲料，周一至周六喂养含胆固醇饲料，周日喂标准兔饲料，总共8w，之后选用总胆固醇试剂盒检测家兔血清总胆固醇，超过10mmol/L，高胆固醇血症SOD兔模型建模成功后，每周前六天每天早上9点，下午5点对各组进行灌胃，CON、HC组家兔给予生理盐水20ml，SGD组给予SGD20ml、PF组用已配制的芍药甙溶液20ml进行灌胃4w，每周休息一天。治疗结束后，每组进行活体腹腔注射5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU），25mg/kg，24h后迅速取SO组织。选用HE染色、透射电镜观察SO组织的病理结构及超微结构的改变、选用免疫荧光检测神经纤维标记物（PGP9.5）、特异性反应ICC起搏功能变化的Ano1蛋白、平滑肌细胞标记物（α-Action）及缝隙连接通道蛋白连接蛋白43（CX43）的表达；选用酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测家兔血清及SO组织中促进收缩的胆囊收缩素（CCK）及促进松弛的一氧化氮（NO）的合成酶一氧化氮合酶（NOS），并观察各组SO内ENS-ICC-SMC网络相关重要蛋白的表达；选用免疫荧光双染BrdU-C-kit:即用C-kit和Brdu标记SO内ICC，此外，选用RT-PCR来检测增殖蛋白MKI67（Ki67）和增殖细胞核抗原（Proliferating cell nuclear antigen，PCNA），观察各组ICC细胞的增殖能力。<br>　　结果：<br>　　1.HE染色检测结果显示：CON组：SO结构清晰，黏膜上皮细胞完整，黏膜固有层伴有少量散在的炎性细胞浸润，相对正常。HC组：SO结构多处受损，黏膜上皮细胞基本完全丢失，黏膜固有层纤维组织疏松水肿，黏膜层伴有大量炎性细胞浸润，炎症最为严重。经过4w灌胃后，SGD及PF组：SO的结构也被部分破坏，黏膜上皮细胞不完整，黏膜固有层出现纤维组织增生，黏膜层伴有些许炎性细胞浸润，较HC组较轻。<br>　　2.透射电镜检查结果显示：CON组：ICC呈梭形，细胞核大（占多数），细胞质少，细胞器丰富，与周围细胞及神经纤维末端连接紧密；HC组：ICC呈不规则形、合成态，重度肿胀，受损严重；较其他三组炎症较重，其超微结构被严重破坏；SGD组：ICC呈长梭形、收缩态，轻中度肿胀，细胞膜完整，周围胶原纤维（CF）数量较多，均匀分布；PF组：ICC呈不规则形，轻中度肿胀，细胞周围胶原纤维（CF）局部稀疏，小面积低电子密度水肿区，胞质内细胞器较少，肿胀、空泡化，两组治疗组超微结构仍被破坏，较HC组减轻，但比CON组严重。<br>　　3.免疫荧光检测各组的表达，结果显示：HC组的表达较CON组减少，SGD组和PF组的PGP.9.5,Ano1，α-action，cx43表达较HC组增多，与CON组相近。<br>　　4.ELSA检测血清及SO的一氧化氮合酶(NOS)及胆囊收缩素（CCK）的结果显示：NOS是NO的合成酶，其表达量的多少即代表NO的表达量。相比CON组，HC组的CCK明显增加，NO明显减少，相比HC组，SGD组与PF组的CCK明显减少而NO有所增加，与CON组相近。<br>　　5.c-Kit与Brdu双染显示：CON组兔SO组织内c-Kit与Brdu双染阳性ICC细胞数量较多；与CON组比较，HC组兔SO组织内c-kit与Brdu双染阳性ICC细胞明显减少，ICC细胞增殖能力明显降低。与HC组比较，SGD与PF治疗组兔SO组织内c-kit阳性ICC细胞增加，ICC细胞增殖有所恢复。<br>　　6.Ki67，PCNA的RT-PCR检测的结果显示：HC组的Ki67、PCNA表达较CON组减少，SGD组和PF组的表达Ki67、PCNA较HC组增多。<br>　　结论：<br>　　1.本实验研究提示SOD的发生和发展与芍药甘草汤及芍药甙治疗SOD与SO中ENS-ICC-SMC关系密切，与CON组相比，HC组神经纤维PGP9.5、特异性反应ICC功能变化的Ano1蛋白、平滑肌细胞标记物α-action、ENS向ICC的信号传递的促动力神经肽CCK，抑制性神经递质NO及ICC与SMC的缝隙连接中的缝隙连接蛋白cx43都受到不同程度的破坏，影响了ENS-ICC-SMC通路的信号传递，出现一定程度的SO运动功能调节障碍，经过SGD及PF治疗一段时间后，与HC组相比，SGD和PF组兔SO组织中PGP9.5、Ano1、cx43、α-action、NO、CCK均有一定程度上改善，逐渐向正常状态恢复。我们推测SOD疾病的发生可能导致ENS-ICC-SMC网络受到破坏，三者之间的信号传递受到破坏，而SGD和PF具有保护恢复ENS-ICC-SMC网络的作用。<br>　　2.ICC作为ENS信号向SMC的传送的信息整合中转站,发挥着重要的作用。本研究提示SOD的发病机制及芍药甘草汤及芍药甙的治疗可能与ICC的增殖能力密切相关，HC的兔SO中，Ano1蛋白，c-kit和Brdu的免疫荧光双染面积及ki67，PCNA减少，ICC的数量及功能既影响了ENS-ICC通路的信号传递，又影响了ICC-SMC的信号传递，从而出现一定程度的SO运动调节障碍。SGD和PF治疗后，Ano1的荧光强度增多，c-kit和Brdu的免疫荧光双染及ki67，PCNA也有一定程度的增多，表明治疗后ICC的功能和数量有所改善，对SO的运动障碍也有所缓解，ICC数量及功能的恢复，促进改善ENS-ICC-SMC信号转导，提示SGD和PF可能通过恢复ICC来影响ENS-ICC-SMC信号转导并调节SO的运动，从而发挥改善Oddi括约肌动力作用。这些观察将有助于新治疗策略的发展，但是，ENS-ICC-SMC之间的调节及细胞增殖机制是非常复杂的，为了支持这种观点，可能需要更多的实验和临床研究。