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摘要炎症反应是机体受到刺激后诱发的防御性应答，多伴随血管内高分子渗出，产生局部水肿和大量的炎性因子。当炎症程度超出正常范围，将诱发组织损伤，如水肿、肺炎。严重时甚至会引发炎症风暴导致全身性系统炎症、多器官功能障碍等进而加重炎症症状，例如近年来流行的新冠肺炎COVID-19。然而，炎症疾病诱因复杂多样，仍需探索新的分子靶点及内在机制。蛋白酶活化受体2（PAR2）是一类由胰酶等蛋白酶激活的G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors,GPCRs)，可通过调控细胞内信号转导介导炎症反应。掌握和运用PAR2在炎症中承担的角色，可能实现人为介入炎症发生过程，引导机体规避炎症疾病。目前，PAR2激动剂较为成熟，但PAR2抑制剂还无法达到精准调控。CRISPR-Cas9系统作为一种新型的基因编辑工具，可代替抑制剂实现PAR2基因的敲除，以探索PAR2对于炎症的作用。然而，CRISPR-Cas9质粒虽然制备工艺简单，但也面临粒径大、难摄取、易降解等问题。纳米粒则是一类常见药物载体，能保护和准确输送核酸药物至靶点，可作为CRISPR-Cas9的递送系统。<br>　　基于此，本课题将PAR2与炎症联系起来，通过靶向递送CRISPR-Cas9系统敲除PAR2，进而探索PAR2对炎症的新作用及分子机制，以期调控PAR2来治疗炎症疾病。主要工作内容如下:<br>　　1.炎症靶向CRISPR-Cas9-PAR2纳米粒（TAP/pCas9-PAR2）的成功构建。首先，选取生物相容性高的血清白蛋白作为CRISPR-Cas9递送载体，同时引入胶原蛋白靶向肽实现炎症靶向。通过改变pH、搅拌速度、搅拌时间、温度和成分等条件筛选出粒径、稳定性和分散性最好的配方。同时，利用细胞转染、摄取和毒性实验，筛选出低毒和高效的纳米粒最优N/P比，成功实现PAR2基因的敲除。<br>　　2.从细胞水平上，探讨PAR2基因敲除后对炎症相关细胞的作用及分子机制。利用qRT-PCR、WB、NO含量检测等实验手段研究敲除PAR2对炎性细胞的基因或蛋白的表达及分泌，揭示了PAR2可通过MAPK/NLRP3/Caspase-1/IL-1β和MAPK/iNOS信号通路调控炎症的作用及分子机制。<br>　　3.从动物水平上，探讨PAR2基因敲除后对小鼠水肿和急性肺炎的炎症作用及机制。构建小鼠PAR2特异性和非特异性两种爪水肿模型，发现敲除PAR2既能治疗由PAR2激动剂诱导的短期爪水肿，又能治疗广义的爪部水肿；利用小鼠急性肺炎模型模拟肺炎冲击下的肺部炎性损伤，揭示了PAR2敲除对于肺部炎性损伤的治疗效果。同时，使用ELISA、WB、BCA、细胞计数等检测方法确认敲除PAR2缓解肺部炎性损伤的作用，并初步探索了治疗效果与NLRP3和iNOS信号转导的相关机制。因此，PAR2可能作为肺炎治疗的新靶点。