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摘要食管癌（Esophagealcancer，EC）是全球范围内常见的消化道恶性肿瘤，发病率位居各类肿瘤中第七位，同时占癌症相关死因第六位。我国是世界上食管癌发病率和死亡率均最高的国家，每年死于食管癌的患者占世界死亡人数的一半以上。鳞状细胞癌（squamouscellcarcinoma，SCC）和腺癌（adenocarcinoma，AC）是食管癌常见的病理类型，其中我国食管癌病例以食管鳞状细胞癌（esophagealsquamouscellcarcinoma，ESCC）为主，占90%以上。由于该病早期症状不明显，患者确诊时即为中晚期，虽然目前医疗技术有所进展，但食管鳞癌患者的5年生存率仍不足30%。临床上急切需要寻找具有高度敏感性和特异性的肿瘤标志物，以便对ESCC患者进行早期诊断和预后评估，甚至通过靶向治疗的方法，控制ESCC的进展。<br>　　近年来，大量研究表明非编码RNA参与人类重要的生理、病理学进程，长链非编码RNAs（LongnoncodingRNAs，lncRNAs）是一类长度大于200bp，不具有编码蛋白能力的RNA分子，在癌症的发生和发展中起到了重要的调控作用。LOC440173为新发现的1个lncRNA，其位于染色体9q21.33，长度为2018bp；有研究发现其在肾癌中高表达，且参与肾癌细胞的增殖过程。然而LOC440173在ESCC中的表达及其生物学功能尚未阐明。本研究首先利用生物信息学数据发现并检测LOC440173在食管鳞癌肿瘤组织及癌旁正常组织中的表达情况，分析其表达水平与患者各临床病理资料的相关性；并通过体外、体内实验，研究LOC440173对食管癌细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响，初步明确其生物学功能；最后探讨LOC440173影响食管癌生物学行为的潜在分子机制。<br>　　主要研究内容和结果如下：<br>　　第一部分长链非编码RNALOC440173在食管鳞癌中的表达及其临床意义<br>　　目的：研究长链非编码RNALOC440173在食管癌细胞系及ESCC组织中的表达及分析其表达水平与患者临床病理特征之间的相关性。<br>　　方法：<br>　　1.从公共数据库GEO中下载食管鳞癌芯片GSE89102数据，并分析其中差异表达的lncRNAs。<br>　　2.应用在线软件CodingPotentialCalculator和CodingPotentialAssessmentTool分析预测LOC440173的蛋白编码能力。<br>　　3.应用实时荧光定量反转录多聚核苷酸酶链式反应（Quantitativereal-timereversetranscriptionpolymerasechainreaction，qRT-PCR）的方法检测LOC440173在5株食管癌细胞系（Kyse150、Eca109、YES-2、TE1、TE13）以及64例ESCC及其相应癌旁正常组织中的表达情况，并分析其表达水平与患者临床病理资料间的相关性。<br>　　4.绘制ROC工作特征曲线分析LOC440173的表达水平在ESCC诊断中的价值。<br>　　结果：<br>　　1.lncRNA芯片分析发现有752个表达差异的lncRNAs，其中334个lncRNAs的表达上调，418个lncRNAs的表达下调；分析发现在上调的lncRNAs中，LOC440173的表达差异3.4倍。<br>　　2.在线软件CodingPotentialCalculator和CodingPotentialAssessmentTool证实LOC440173是一个非编码RNA。<br>　　3.LOC440173在食管癌细胞系中的表达情况：LOC440173在食管癌细胞系（YES-2、Kyse150、TE13、Eca109、TE1）中表达均高于对照组（P＜0.01）。<br>　　4.LOC440173在ESCC及其相应癌旁正常组织中的表达情况：LOC440173在ESCC组织中的表达显著高于相应癌旁正常组织，并且与分化程度、浸润深度、淋巴结转移和TNM分期密切相关（P＜0.05或P＜0.01），而与性别、年龄无关（P＞0.05）。<br>　　5.工作特征曲线（ROC）分析发现LOC440173鉴别ESCC及癌旁正常组织的曲线下面积为0.7205，敏感性为70.31%，特异性为70.31%（P＜0.01）。<br>　　第二部分长链非编码RNALOC440173对食管癌细胞生物学行为的影响<br>　　目的：通过体内外实验，研究LOC440173对食管癌细胞恶性行为的影响。<br>　　方法：<br>　　1.构建LOC440173的4个敲低质粒及pcDNA3.1-LOC440173过表达载体，分别转染食管癌细胞Kyse150、YES-2和TE1、Eca109，采用qRT-PCR的方法检测转染效率。选择敲低效果最好的sh-LOC440173-1进行后续实验。分别应用MTS、克隆形成、Transwell小室和细胞周期等实验检测敲低及过表达LOC440173对食管癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。<br>　　2.采用qRT-PCR和Westernblot方法检测在Kyse150和Eca109细胞中分别敲低和过表达LOC440173对EMT相关基因的影响。<br>　　3.应用体内移植瘤实验检测在Eca109细胞中过表达LOC440173对裸鼠移植瘤生长的影响。<br>　　结果：<br>　　1.成功构建敲低和过表达LOC440173细胞株：转染sh-LOC440173-1可显著敲低LOC440173在食管癌细胞Kyse150和YES-2中的表达水平（P＜0.05或P＜0.01），转染pcDNA3.1-LOC440173的食管癌细胞TE1和Eca109中，LOC440173表达明显上调（P＜0.01）。<br>　　2.敲低LOC440173可显著抑制Kyse150和YES-2细胞的增殖、迁移、侵袭能力，G0/G1期细胞增多（P＜0.05或P＜0.01）。而过表达LOC440173可显著促进TE1和Eca109细胞的增殖、迁移、侵袭能力，G0/G1期细胞减少（P＜0.01）。<br>　　3.qRT-PCR和Westernblot结果显示，在Kyse150中，敲低LOC440173后，E-cadherin表达水平升高，N-cadherin和Vimentin表达水平降低（P＜0.01）。在Eca109细胞中，过表达LOC440173后，E-cadherin表达水平降低，N-cadherin和Vimentin表达水平升高（P＜0.01）。<br>　　4.体内移植瘤实验结果显示，注射稳定过表达LOC440173细胞的小鼠与对照组相比，体内的移植瘤的体积和重量明显增加（P＜0.01）。<br>　　第三部分长链非编码RNALOC440173通过吸附miR-30d-5p促进食管癌的恶性进展<br>　　目的：研究LOC440173在食管癌的致癌过程中对miR-30d-5p的调控作用。<br>　　方法：<br>　　1.应用Paris试剂盒分离食管癌细胞系Kyse150、YES-2、Eca109和TE1的细胞核和胞浆，应用qRT-PCR法检测LOC440173在四株细胞系中的核浆定位。<br>　　2.生物信息学工具预测与LOC440173有潜在结合的miRNA。<br>　　3.应用双荧光素酶报告基因实验和RNA免疫共沉淀（RNAimmunoprecipitation，RIP）实验证实LOC440173是否以竞争性内源RNA（ceRNA）形式吸附miR-30d-5p。<br>　　4.采用qRT-PCR方法检测64例ESCC及其相应癌旁正常组织中miR-30d-5p的表达情况，并分析其表达水平与患者临床病理资料间的相关性。<br>　　5.合成miR-30d-5pmimics和inhibitor，分别转染食管癌细胞Kyse150和TE1后，用qRT-PCR的方法检测转染效率。分别应用MTS实验、克隆形成实验、Transwell实验来检测敲低和过表达miR-30d-5p对食管癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。<br>　　6.将LOC440173和miR-30d-5p共转染至食管癌细胞，分别应用MTS实验、克隆形成实验、Transwell实验来检测LOC440173及miR-30d-5p对食管癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。<br>　　结果：<br>　　1.LOC440173在食管癌细胞中主要定位在胞浆中。<br>　　2.生物信息学预测LOC440173序列中含有与miR-30d-5p互补结合的miRNA反应原件（miRNAresponseelements，MREs）；敲低LOC440173后食管癌细胞中miR-30d-5p表达明显升高（P＜0.01），而LOC440173过表达后食管癌细胞中miR-30d-5p表达明显降低（P＜0.05或P＜0.01）。<br>　　3.双荧光素酶报告基因与RIP实验证实LOC440173能够以ceRNA的形式吸附miR-30d-5p。<br>　　4.miR-30d-5p在ESCC组织中的表达水平显著低于相应癌旁正常组织，并且与分化程度、浸润深度、淋巴结转移和TNM分期密切相关（P＜0.05或P＜0.01）。<br>　　5.通过转染miR-30d-5pmimics显著上调miR-30d-5p在食管癌细胞系Kyse150和TE1中的表达水平，而转染miR-30d-5pinhibitor明显下调miR-30d-5p在食管癌细胞系Kyse150和TE1中的表达水平。体外实验证实，过表达miR-30d-5p可显著抑制Kyse150和TE1细胞的增殖、迁移和侵袭能力（P＜0.05或P＜0.01），敲低miR-30d-5p可显著促进Kyse150和TE1细胞的增殖、迁移和侵袭能力（P＜0.05或P＜0.01）。<br>　　6.在Kyse150中，共转染miR-30d-5pinhibitor后可部分恢复敲低LOC440173对细胞增殖、迁移和侵袭能力的抑制作用（P＜0.05或P＜0.01）。在TE1细胞中，共转染miR-30d-5pmimics后，可部分恢复过表达LOC440173对细胞增殖、迁移和侵袭能力促进作用（P＜0.05或P＜0.01）。<br>　　第四部分长链非编码RNALOC440173通过调控miR-30d-5p/HDAC9促进食管鳞癌的进展<br>　　目的：探讨LOC440173、miR-30d-5p和HDAC9在食管癌发生发展中的作用。<br>　　方法：<br>　　1.利用生物信息学在线工具预测miR-30d-5p的靶基因，发现HDAC9可能是miR-30d-5p的靶基因。并用TargetScan预测HDAC9的3’-UTR区域和miR-30d-5p的结合序列。<br>　　2.应用qRT-PCR实验和双荧光素酶报告基因实验进一步验证LOC440173/miR-30d-5p对HDAC9调控作用。<br>　　3.应用qRT-PCR方法检测64例ESCC组织及其相应癌旁正常组织中HDAC9的表达情况。并分析ESCC组织中LOC440173、miR-30d-5p和HDAC9三者表达的相关性。<br>　　4.分别应用MTS和Transwell小室实验检测Eca109和TE1细胞中转染pcDNA3.1-LOC440173，及共转染siHDAC9后对食管癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。<br>　　结果：<br>　　1.多个生物信息学数据库预测HDAC9可能为miR-30d-5p的靶基因。在Kyse150和TE1细胞中过表达miR-30d-5p后，HDAC9的表达水平明显下降（P＜0.05或P＜0.01），而敲低miR-30d-5p后，HDAC9的表达水平明显上调（P＜0.01）。荧光素酶报告基因实验证实miR-30d-5p可以和HDAC9的3’-UTR区域结合。<br>　　2.在Kyse150细胞中，敲低miR-30d-5p后，可以部分恢复LOC440173减少而引起的对HDAC9的mRNA表达水平和荧光活性的抑制作用（P＜0.05或P＜0.01）。在TE1细胞中，过表达miR-30d-5p后，可部分减弱由LOC440173过表达对HDAC9的mRNA表达水平和荧光活性的促进作用（P＜0.05或P＜0.01）。<br>　　3.HDAC9基因在ESCC组织中的表达显著高于相应癌旁正常组织（P＜0.05）。相关性分析发现miR-30d-5p的表达与LOC440173和HDAC9的表达分别呈负相关，而LOC440173的表达与HDAC9的表达呈正相关（P＜0.01）。<br>　　4.在Eca109和TE1细胞中，共转染siHDAC9后可减弱LOC440173过表达对细胞增殖、迁移和侵袭能力的促进作用（P＜0.05或P＜0.01）。<br>　　结论：<br>　　1.LOC440173在食管癌细胞和ESCC组织中表达增高，并与ESCC的发生与发展密切相关，可以作为ESCC诊断和预后的分子标志物。<br>　　2.LOC440173可显著促进食管癌细胞的体外增殖、迁移、侵袭能力和体内肿瘤生长能力，且可能通过调控EMT相关基因而发挥致癌作用。<br>　　3.LOC440173通过调控miR-30d-5p/HDAC9促进食管鳞癌的进展。