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摘要全脱位通常发生在牙外伤的情况下，是指牙齿完全脱出牙槽窝外，牙髓及牙周膜同时损伤，牙槽窝变得空虚。这是口腔领域的常见病和多发病。恒前牙全脱位尤其多见，往往发生于青少年时期。这种损伤是由于突发性的外力作用，摔伤、暴力、交通事故等因素，导致牙齿完全从牙槽窝内脱出，牙髓和牙周韧带断裂。这类牙外伤导致的牙齿损伤最为严重，且预后往往不佳，如果处理不当会导致咀嚼功能丧失等难以弥补的创伤。临床上在条件允许的情况下，可以将脱落的牙齿再植入。但这种植入的牙齿，已经不能再重建天然的牙髓和牙周膜结构。大多数存活下来的牙也是死髓牙，牙色灰暗，牙体缺乏生命的活力。同时也缺少牙周膜，牙体与牙槽骨之间以骨性整合连接。患者丧失了天然的牙髓和牙周膜，长期下来，这种植入的牙齿会因釉质崩解脱落，牙根吸收而彻底丧失功能。因此，对于全脱位牙齿的牙髓及牙周膜的修复再生，一直成为口腔科学领域的重大难题，至今尚未得到解决。<br>　　组织工程学技术，是利用从机体提取具有自我更新和多向分化潜能的干细胞，体外增殖培养后，生长于特定的生物支架材料上，构建组织工程化复合体，应用于机体的修复。并可根据机体微环境需要，提供相应的生长因子，促进组织损伤修复、组织器官再生。组织工程学技术的发展和应用，为本课题的全脱位牙齿的牙髓及牙周膜的修复和再生，提供了技术支持和保障。<br>　　种子细胞，是组织工程学中用于再生组织及器官的各类干细胞的统称。干细胞可以从机体中获得并可在体外分离、扩增，与支架结构复合后可植入组织损伤的位置，是组织再生与修复的起源细胞。目前研究认为干细胞根据其来源可分为：胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞是全能细胞。但由于对胚胎干细胞伦理学的严格管控和其生长和分化的难以控制，近年来研究的焦点依旧集中在成体干细胞的方向。人脐带间充质干细胞（human-um-bilicalcordmesenchymalstemcells，hUCMSCs）作为间充质干细胞家族中的一员，来源于脐带组织，具有比其他成体干细胞更加良好的多向分化潜能、自我更新能力和低免疫原性。因此，已有很多学者利用人脐带间充质干细胞做为种子细胞用于研究组织修复和再生。但目前，关于将人脐带间充质干细胞做为种子细胞植入牙周间隙和髓腔系统内，促进牙髓牙周再生的报道罕见。<br>　　浓缩生长因子（concentrategrowthfactors,CGF）纤维蛋白，作为新一代的血小板浓缩制剂，是通过差速离心的方式进行制备。CGF中含有的大量纤维蛋白胶原，形成三维网状结构，且其结构较前两代更加稳定。这种稳定的纤维蛋白网格状结构为细胞的攀附和黏着提供了稳定的物理平台。同时纤维呈现三维方向连接，有利于细胞的迁移，而网格空间的存在也利于营养物质和氧气的输送及代谢产物的排出。另外，CGF中含有离心血液中绝大多数的生长因子，在应用的过程中会缓慢的释放，进而使得患者的组织愈合往往更加迅速与自然。CGF已经被广泛应用于临床，但是，做为组织工程的支架结构携带人脐带间充质干细胞促进体内牙髓及牙周损伤修复的相关研究及其作用机制研究较为少见。<br>　　TAZ又称WWTR1基因，位于人类3q23-q24染色体上。最初发现TAZ是一种结合蛋白，可进入细胞核，与转录因子结合，激活转录因子活性，促进基因表达。以往研究表明TAZ可以抑制间充质干细胞PI3K/Akt通路，从而促进细胞的成骨分化。下调Smad4/TAZ轴可导致间充质干细胞延迟成骨分化，增加脂肪生成。但TAZ对人脐带间充质干细胞和CGF膜共培养体系增殖和分化影响的研究未见报道。<br>　　本实验分离提取人脐带间充质干细胞，与采集静脉血差速离心制备的CGF膜在体外复合培养，构建组织工程化牙髓牙周复合体。然后将复合体，从根尖孔充填进全脱位离体的犬恒前牙的牙髓腔内；同时将复合体包裹牙周间隙，植入牙槽窝内，纤维带弹性固定。继续饲养动物3个月，随后组织学观察牙髓及牙周恢复、再生情况。并从分子生物学方面，探寻人脐带间充质干细胞，促进牙髓牙周再生的机制。为临床全脱位恒前牙的牙髓牙周组织再生，提供理论依据与实验数据。争取早日应用于临床，为患者带来福音。<br>　　本研究分为三部分，各部分内容摘要如下：<br>　　第一部分人脐带间充质干细胞体外培养与鉴定<br>　　目的：分离提取人脐带间充质干细胞，体外培养并鉴定形态学和生物学特征。<br>　　方法：收集健康足月产新生儿，断脐后的脐带10cm。剥离凝胶状华通氏胶，采用组织块法分离提取人脐带间充质干细胞。体外增殖培养，取第三代对数生长期细胞在倒置显微镜、扫描电镜下观察细胞形态，细胞免疫组织化学Vimentin染色、流式细胞术鉴定细胞来源，绘制细胞生长曲线检测细胞增殖情况，茜素红染色检测细胞成骨分化能力。<br>　　结果：倒置显微镜观察10天左右，细胞从组织块边缘逐渐爬出贴壁生长，原代细胞形态不均一，呈多角形、星形，短梭形或长梭形；细胞传代到第三代时，细胞均一性好，呈长梭状、成纤维状，胞质丰富，核大，增殖后呈旋涡状排列。扫描电镜观察，细胞体积较大，轮廓清楚，多为突起的纺锤状或多角形结构，胞核呈规则的卵圆形，核仁大而清晰。免疫组化染色光镜下观察，Vimentin染色阳性，细胞胞质呈棕黄色，细胞核蓝染；CK染色阴性，符合间充质来源的细胞特征。流式细胞仪分析结果显示干细胞表面标记物CD29、CD44、CD146和CD105阳性表达，造血标记物CD34和CD45为阴性表达。表明培养的hUCMSCs来源于中胚层间充质组织。细胞增殖曲线呈“S”形。茜素红色矿化实验成骨分化诱导液培养21d后，可见大量红色钙化结节形成。表明培养的hUCMSCs具有横向增殖分化的干细胞特性。<br>　　小结：分离提取的人脐带间充质干细胞为中胚层间充质来源，具有干细胞的增殖分化特性。<br>　　第二部分CGF膜构建组织工程化牙髓及牙周复合体<br>　　目的：原代培养的人脐带间充质干细胞做为种子细胞，在体外与制备的浓缩生长因子（CGF）复合培养，构建组织工程化复合体。组织学观察鉴定。观察体外CGF膜对人脐带间充质干细胞增殖和成骨分化的影响。观察转录共激活子TAZ在人脐带间充质干细胞中的表达情况及CGF膜对其表达的影响；通过分子生物学方法构建过表达或者沉默TAZ细胞系，进一步观察TAZ在人脐带间充质干细胞成骨分化中的作用及CGF膜对其作用的影响情况。<br>　　方法：抽取健康志愿者静脉血差速离心后纱布压膜法获得CGF膜，组织学切片HE染色、扫描电镜观察微观结构。以实验第一部分培养鉴定后的人脐带间充质干细胞做为种子细胞，培养至第三代对数生长期后，消化离心将细胞悬液接种于CGF膜上，37℃、5%CO2培养箱中孵育培养7天。采用倒置显微镜、组织学切片HE染色、扫描电镜等方法观察鉴定组织工程化复合体的构建。体外建立人脐带间充质干细胞与CGF共培养体系，通过MTT检测细胞增殖情况，茜素红染色检测矿化形成情况，免疫荧光染色检测骨桥蛋白的表达，碱性磷酸酶活性检测，观察CGF对人脐带间充质干细胞增殖和分化的影响。WesternBlot检测TAZ在人脐带间充质干细胞细胞核和细胞质中的表达；制备用于过表达Tafazzin(pc-TAZ)和敲除TAZ(shTAZ)的慢病毒质粒，茜素红染色观察过表达和敲除TAZ对人脐带间充质干细胞成骨能力的影响。<br>　　结果：CGF膜HE染色观察，镜下见CGF膜为纤细的网状结构，其中纤维蛋白网状结构为主体结构。扫描电镜观察呈致密三维立体网状结构，纤维间孔隙较小。组织工程化复合体构建后，倒置显微镜下可见人脐带间充质干细胞由CGF膜表面爬出，膜周边细胞呈长梭形，排列紧密，细胞的长轴与CGF表面基本垂直，以膜为中心呈现放射性生长。扫描电镜观察，人脐带间充质干细胞在CGF膜上充分伸展，紧密贴附，生长良好，形态正常，可见围绕孔隙均匀分布生长。MTT检测、茜素红染色、免疫荧光染色检测骨桥蛋白的表达和碱性磷酸酶检测结果均表明CGF促进人脐带间充质干细胞的增殖和成骨分化；WesternBlot检测表明，CGF纤维蛋白膜除了影响人脐带间充质干细胞的基本生理功能外，还可调节细胞内成骨相关基因RUNX2、OCN和ALPmRNA表达上调。TAZ在细胞核和细胞质中的表达检测表明，经CGF纤维蛋白膜干预后，TAZ在细胞质和细胞核中的表达显著上调，说明CGF纤维蛋白膜促进了TAZ的表达及核转移；茜素红检测表明，CGF可以进一步促进过表达TAZ后人脐带间充质干细胞矿化能力的提高，拮抗TAZ敲除后矿化能力减弱的情况。<br>　　小结：人脐带间充质干细胞在CGF膜上生长良好，CGF膜具有良好的生物相容性，体外成功构建组织工程化牙髓牙周复合体。CGF膜可以促进人脐带间充质干细胞的增殖和成骨分化；CGF可促进TAZ在人脐带间充质干细胞细胞质和细胞核中的表达，促进TAZ的核转移；过表达TAZ可促进人脐带间充质干细胞矿化能力的提高，敲除TAZ后人脐带间充质干细胞矿化能力减弱；CGF可逆转敲除TAZ后的抑制作用，增强过表达TAZ后的促进作用。<br>　　第三部分全脱位恒前牙牙髓牙周再生的动物实验<br>　　目的：将体外构建的组织工程化复合体植入犬全脱位再植的恒前牙牙周间隙及去除牙髓组织的根管系统内，观察牙髓牙周组织修复再生情况。<br>　　方法：6只健康成年比格犬，牙列完整且无牙体牙周疾患，无全身系统性疾病。每只比格犬选取上下颌切牙做为实验牙齿，实验牙位间隔选取，6只犬共得36颗牙齿。将36颗牙齿经随机数字表随机化后编入3个实验组，正常对照组、创伤未治疗组和组织工程化复合体组，每组12颗牙。实验动物术前12小时禁食水，臀部肌肉注射陆眠宁诱导麻醉，戊巴比妥钠肌注加深麻醉。实验犬俯卧固定于手术台，术区消毒铺巾，手术区域给于盐酸利多卡因局部浸润麻醉。根据分组编号进行实验牙位手术。正常对照组不给与任何处理；创伤未治疗组及组织工程化复合体组需拔出实验牙进行干预处理。后两组牙齿用拔牙钳拔出，无菌纱布手持固定实验牙，高速涡轮手机在冷水喷雾冷却下，用高速锋利裂钻截除牙根尖3mm牙体组织。拔髓针自根尖孔向上插入根管内，去除根管内牙髓组织，用镍钛开口锉及K形根管锉逐号增加进行根管内的倒预备，将截断处根尖孔直径扩大到1mm。生理盐水冲洗牙根，置于无菌不锈钢托盘内，室温下干燥放置1小时确保牙周膜组织广泛坏死。根面刮治器轻柔去除坏死牙周膜。创伤未治疗组，不做其他处理直接将已去除牙髓和牙周组织的牙根再植回牙槽窝内；组织工程化复合体组需将组织工程复合体自倒预备后的根尖孔放入根管及髓腔内，根尖区包裹组织工程化复合体再植入牙槽窝内。使用光固化流动树脂将固定纤维带粘接于牙面做为牙周夹板弹性固定术区牙齿。术后3周去除弹性固定纤维带，术后12周处死动物。取颌骨固定后按牙位切割分离为约5-8mm厚同时含有实验用牙及其牙周组织的组织块，标号，脱钙、包埋、切片、HE染色，进行组织切片观察比较不同组牙髓牙周修复情况，并进行统计学分析。<br>　　结果：术后12周组织学观察发现，正常对照组：牙髓腔内可见少量牙髓细胞，胶原纤维呈束状排列，血管轻度扩张。成牙本质细胞呈扁平状，单层排列，紧贴于牙本质的髓腔端，前期牙本质不明显。牙周膜胶原纤维束状排列，位于牙骨质和固有牙槽骨内的穿通纤维不明显。创伤未治疗组：髓腔内空虚，无牙髓形成，无前期牙本质，可见破碎的残存物（牙本质崩解物）。牙周未见牙周膜结构，固有牙槽骨与牙骨质界面出现大量破骨细胞和吸收陷窝。组织工程化复合体组：牙髓腔内可见新生牙髓形成。新生牙髓血管丰富充盈，牙髓细胞丰富，新生的胶原纤维呈束状或车辐状排列。成牙本质细胞呈圆形，复层排列，位于前期牙本质层的髓腔端。前期牙本质以及钙质小球清晰可见。牙周新附着形成，牙周膜纤维斜行排列。位于牙骨质与固有牙槽骨内的穿通纤维清晰可见。<br>　　小结：人脐带间充质干细胞与CGF膜构建的组织工程化牙髓牙周复合体，能够成功修复全脱位犬恒前牙的牙髓及牙周组织，使其奇迹般的再生，达到最为理想的类似天然牙牙髓及牙周组织的形态学结构。<br>　　结论：<br>　　1.人脐带间充质干细胞，能够成为牙髓牙周再生的理想干细胞。<br>　　2.CGF膜能够成为牙髓牙周再生的理想支架材料。<br>　　3.CGF膜可以促进hUCMSCs的增殖和成骨分化；CGF可促进TAZ在hUCMSCs细胞质和细胞核中的表达，促进TAZ的核转移；过表达TAZ可促进hUCMSCs矿化能力的提高，敲除TAZ后hUCMSCs矿化能力减弱；CGF可逆转敲除TAZ后的抑制作用，增强过表达TAZ后的促进作用。<br>　　4.人脐带间充质干细胞与CGF膜构建的组织工程化牙髓牙周复合体，能够成功修复再生牙髓牙周组织，达到最为理想的类似天然牙的形态学结构。