检索历史 清除

摘要目的：下丘脑室旁核(paraventricularnucleusofhypothalamus,PVN)是调节神经内分泌功能和心血管交感神经紧张性的重要部位。PVN前交感神经元过度兴奋是高血压时交感传出活动增强的重要机制之一，但人们对PVN前交感神经元过度兴奋的来源和机制仍知之甚少。在高血压患者和自发性高血压大鼠(spontaneouslyhypertensiverat,SHR)，下丘脑室旁核促肾上腺皮质激素释放激素（PVN-Corticotropin-ReleasingHormone，PVN-CRH）神经元对应激刺激的反应明显增强，下丘脑-垂体-肾上腺（hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA）功能轴过度激活。但高血压时交感系统功能紊乱和神经内分泌功能失调之间有无功能联系，以及PVN-CRH神经元和PVN前交感神经元之间有无相互作用尚未知晓。本研究旨在应用电生理学、分子生物学、化学遗传学等方法揭示高血压时PVN-CRH神经元对PVN前交感神经元的调控在高血压交感传出活动过度激活中的作用。<br>　　方法：<br>　　本研究选用成年SHR和正常血压（WistarKyotoRat，WKY）大鼠，应用免疫荧光共定位技术测定PVN-CRH神经元c-Fos的表达，通过CRH和c-Fos免疫共定位占CRH阳性细胞的百分比比较WKY和SHR中PVN-CRH神经元的激活程度。应用Real-timePCR和Westernblot技术测定PVN和延髓头端腹外侧区（rostralventrolateralmedulla，RVLM）等脑区CRHR1和CRHR2的mRNA和蛋白表达水平。通过动脉插管和电生理学方法描记麻醉大鼠的动脉血压（bloodpressure，BP）和肾交感神经放电（renalsympatheticnerveactivity，RSNA），PVN微量注射CRHR1的抑制剂NBI-35965及CRHR2抑制剂Antisauvagine-30，观察大鼠动脉血压和肾交感神经放电变化。应用化学遗传学技术，将AAV1/2-RatCRHpromoter-Cre病毒与pAAV-hsyn-DIO-hM3D(Gq)-eGFP病毒或pAAV-hsyn-DIO-hM4D(Gi)-mCherry病毒分别注入到WKY大鼠和SHR大鼠的PVN脑区，WKY大鼠PVN-CRH神经元表达兴奋性DREADDM3，SHR大鼠PVN-CRH神经元表达抑制性DREADDM4。向脊髓中间外侧柱（intermediolateralcolumn，IML）注射荧光微球，逆行标记PVN前交感神经元，应用hM3Dq和hM4Di的配体氯氮平-N-氧化物（ClozapineN-oxide，CNO）灌流脑片，激活或抑制有hM3Dq和hM4Di表达的PVN-CRH神经元，全细胞电流钳、电压钳分别记录PVN前交感神经元膜电位的变化、电流诱发的动作电位发放频率和微小兴奋性突触后电流（miniatureexcitatorypostsynapticcurrent，mEPSC）的变化。应用CRHR1抑制剂NBI-35965及CRHR2抑制剂Antisauvagine-30灌流脑片，脑片膜片钳技术观察PVN前交感神经元膜电位、注入电流诱发的动作电位的发放频率和mEPSC的变化。<br>　　结果：<br>　　1.与WKY大鼠相比，SHR大鼠PVN中CRH神经元的CRH阳性细胞个数增加（P＜0.01），c-Fos+和CRH+双阳性细胞占CRH+细胞的百分比增加（P＜0.001），表明SHR大鼠PVN-CRH神经元过度激活。<br>　　2.Real-timePCR结果显示，与WKY大鼠相比，SHR大鼠PVN组织中CRHR1mRNA表达明显增多（P＜0.001），但CRHR2mRNA的表达在两组大鼠之间无差异。而对照脑区RVLM中CRHR1和CRHR2mRNA表达在两组大鼠均无显著差异。<br>　　3.Westernblot结果显示，与WKY大鼠相比，SHR大鼠PVN中CRHR1蛋白表达明显增多(P＜0.001)，但CRHR2蛋白表达在两组动物之间无差异。而对照脑区RVLM中CRHR1和CRHR2蛋白表达在两组大鼠均无显著差异。<br>　　4.PVN中微量注射CRHR1的抑制剂NBI-35965可降低麻醉状态下SHR大鼠的动脉血压（P＜0.05），减少肾交感神经放电（P＜0.001），而在WKY大鼠PVN中微量注射CRHR1的抑制剂NBI-35965无此效应。此外，在WKY和SHR大鼠PVN微量注射CRHR2抑制剂Antisauvagine-30，血压和肾交感神经放电均无明显变化。<br>　　5.应用化学遗传学方法用人工脑脊液灌流给予CNO抑制SHR的PVN-CRH神经元的功能后，荧光标记的PVN前交感神经元的mEPSC明显受到抑制（P＜0.001），而膜电位和注入电流诱发的动作电位发放频率和放电数目均无明显差异。此外，CNO激活WKY的PVN-CRH神经元的功能后，PVN前交感神经元诱发的动作电位发放频率和mEPSC均无明显差异。<br>　　6.CRHR1的抑制剂NBI-35965灌流后可使SHR大鼠PVN前交感神经元的膜电位超极化（P＜0.05），诱发的动作电位发放频率和mEPSC的频率明显降低（P＜0.001），但上述参数在WKY大鼠无明显变化。而应用CRHR2的抑制剂Antisauvagine-30对WKY和SHR脊髓投射的PVN前交感神经元的膜电位、诱发的动作电位发放频率以及mEPSC均无明显差异。<br>　　结论：<br>　　高血压时，PVN-CRH神经元兴奋性增高，释放CRH增多，作用于向脊髓IML投射的PVN前交感神经元的CRHR1，使PVN前交感神经元兴奋性增加，交感传出活动增加、动脉血压增高。