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过表达circ-LARP7通过上调miR-302a-3p抑制血管平滑肌细胞自噬的机制研究

摘要目的:<br>  血管平滑肌细胞(vascularsmoothmusclecell,VSMC)是构成血管中膜的主要细胞成分,是机体重要的代谢和内分泌器官之一。VSMC的功能在各种心血管疾病的发展中起着重要作用。VSMC的异常增殖会导致新内膜形成,最终引发心血管增生性疾病。而VSMC的异常自噬则会使内环境紊乱,导致动脉粥样硬化和再狭窄。环状RNA(circularRNA,circRNA)是一类呈封闭环状结构的非编码RNA,表达稳定,不易降解,具有组织特异性。我们用PDGF诱导血管平滑肌细胞(humanaorticsmoothmusclecell,HASMC)自噬并通过基因芯片分析了差异表达的circRNA,结果显示circ-LARP7显著下调。此外我们通过生物信息学分析了与circ-LARP7互作的分子,发现与自噬密切相关。因此,我们猜测circ-LARP7可能通过某些机制影响自噬的发生发展,以期为心血管疾病提供潜在的治疗靶点,为探索circRNA影响HASMC自噬的途径提供新的见解和思路。<br>  方法:<br>  1.我们通过基因芯片在PDGF-BB诱导的HASMC自噬模型模型中筛选差异表达的circRNA。通过circBank、circInteractome和miRDB数据库分析这些差异表达的circRNA相互作用的miRNA。通过联合运用miRTarBase、TargetScan、miRWalk和RNAhybrid数据库预测miRNA相互作用的靶mRNA。<br>  2.在细胞水平,一方面我们通过qRT-PCR、核质分离、RNaseR处理、放线菌素D处理等实验对circ-LARP7进行鉴定。另一方面我们通过westernblot、qRT-PCR、LC3自噬双荧光检测、CCK-8、EDU等实验检测circ-LARP7及miR-302a-3p对血管平滑肌细胞自噬和增殖的影响。并通过双荧光素酶报告基因实验验证ULK1/BECN1与miR-302a-3p的靶向关系。<br>  3.在动物水平,我们构建了小鼠颈总动脉内膜增生模型,转入miRNA后通过免疫荧光对增殖和自噬相关指标进行检测。<br>  结果:<br>  1.我们通过基因芯片结合qRT-PCR验证选择了在PDGF-BB诱导的HASMC自噬模型中下调的circ-LARP7。通过生物信息学分析,一方面发现miR-302a-3p和circ-LARP7有5个相互作用位点。另一方面结合GO和pathway分析选择了与自噬相关的miR-302a-3p的靶基因ULK1和BECN1,并通过双荧光素酶报告基因实验验证了这一靶向关系。<br>  2.在细胞水平,通过qRT-PCR、核质分离、RNaseR处理、放线菌素D处理等实验显示circ-LARP7是由LARP7第8号内含子环化而成的circRNA,在胞质和胞核中均有分布,且稳定性更高。通过westernblot、qRT-PCR、LC3自噬双荧光检测、CCK-8、EDU等实验显示miR-302a-3p和circ-LARP7均能明显抑制HASMC自噬和增殖,并且circ-LARP7能显著提高miR-302a-3p的表达。<br>  3.在动物水平,转入miR-302a-3p后通过免疫荧光结果显示与细胞水平一致,miR-302a-3p能明显抑制VSMC的自噬影响增殖。<br>  结论:<br>  circ-LARP7通过miR-302a-3p-ULK1/BECN1途径抑制HASMC自噬的发生发展,从而调控许多心血管疾病。其中的这些分子可能是治疗心血管疾病潜在的靶点。

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