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摘要目的：骨髓增生异常综合征(myelodysplasticsyndromes，MDS)是异质性克隆性髓系恶性肿瘤，在血液系统疾病中发病率极高，且极难治愈，10年生存率不足5%，特别是复发难治性和大于60岁的老年患者[1]。MDS中多存在DNA高甲基化(DNAmethylation)，抑癌基因失活，近年来学者们对表观遗传学的研究高度重视，发现甲基化修饰可以被逆转[2]。目前在MDS的治疗中应用最为广泛的去甲基化药物(hypomethylatingagent，HMA)，包括阿扎胞苷(Azacytidine，AZA)和地西他滨(decitabine，DAC)取得了一定的成绩，但其缓解率及疗效尚未令人满意，且易耐药、复发。近来免疫疗法，特别是免疫检查点抑制剂（Immunecheckpointinhibitors，ICI）在多种实体瘤中取得了重大进展，而程序性细胞死亡蛋白-1(programmeddeath-1，PD-1)与程序性细胞死亡蛋白配体1（Programmeddeath-1ligand，PD-L1）作为一对免疫共抑制分子成为研究热点[3]。目前已被FDA批准的抗PD-1单抗，包括Nivolumab单抗，pembrolizumab单抗等，不仅用于多种实体瘤，而且在霍奇金淋巴瘤的治疗中也已取得一定的成就[4]。令人鼓舞的是，PD-1/PD-L1在MDS中的作用也屡见报道，有望成为新的治疗靶点。然而，目前缺乏其在血液系统疾病尤其是MDS的大型临床研究。本研究通过应用流式细胞技术（Flowcytometry，FCM）和实时荧光RT-PCR定量技术检测MDS患者HMA治疗前后外周血免疫细胞变化及PD-1/PD-L1、PD-1mRNA/PD-L1mRNA表达变化。探索MDS患者在应用HMA治疗过程中产生耐药的机制。<br>　　方法：本实验标本来源于2019年10月至2021年03月河北医科大学第二医院血液内科住院患者，纳入中、高危MDS患46例（其中18例接受DAC方案治疗，28例接受AZA方案治疗），正常对照组5例。MDS患者接受DAC20mg/m2/d×5d天或AZA75mg/m2/d×7d的化疗方案。采集入组患者治疗前及治疗后14天外周血、骨髓液。1)FCM检测HMA治疗前后外周血CD3+CD4+T、CD3+CD8+T淋巴细胞、Treg细胞、B细胞及NK细胞；2)FCM检测HMA治疗前后外周血CD3+CD4+T、CD3+CD8+T淋巴细胞上PD-1和骨髓单个核细胞上PD-L1的表达变化；3)应用实时荧光RT-PCR定量技术检测HMA治疗前后外周血单个核细胞（peripheralbloodmononuclearcells，PBMC）上PD-1mRNA及骨髓单个核细胞（Bonemarrowmononuclearcells，BMMC）上PD-L1mRNA相对表达量变化。同时收集所有入组患者的详细临床相关资料。资料数据采用SPSS22.0软件分析，Plt;0.05差异有统计学意义。<br>　　结果:<br>　　1.FCM检测HMA治疗前后MDS患者外周血淋巴细胞比例的变化：<br>　　1.1HMA治疗前MDS患者外周血淋巴细胞比例变化(表1/图2)<br>　　MDS患者外周血CD3+CD4+T淋巴细胞比例为（27.54±7.61)%、CD4+/CD8+比值为（0.89±0.48），低于正常对照组（P=0.02、0.01）；CD3+CD8+T淋巴细胞比例为（34.13±6.83）%、Treg细胞比例为（9.63±2.74）%，高于正常对照组（P=0.02、0.01）。外周血B淋巴细胞、NK细胞比例，与正常对照组比无差别（Pgt;0.05）。<br>　　1.2HMA治疗后MDS患者外周血淋巴细胞比例变化(表2/图2)<br>　　MDS患者HMA治疗后外周血CD3+CD4+T淋巴细胞比例为（40.01±12.62)%、CD4+/CD8+比值为（1.88±1.34），与治疗前比显著升高（P=0.00）；CD3+CD8+T淋巴细胞比例为（25.76±7.46）%、Treg细胞比例为（5.21±2.69）%，治疗前比显著降低（P=0.00）。外周血B淋巴细胞、NK细胞比例，与治疗前比无差别（Pgt;0.05）。<br>　　2.FCM检测HMA治疗前后MDS患者外周血T淋巴细胞上PD-1表达变化：<br>　　2.1HMA治疗前MDS患者外周血T淋巴细胞上PD-1表达(表3/图3)<br>　　MDS患者外周血CD3+CD4+T淋巴细胞上PD-1平均表达值为（10.53±5.27)%、CD3+CD8+T淋巴细胞上PD-1平均表达值为（11.45±4.95）%，与正常对照组比均显著升高（P=0.01、0.01）。<br>　　2.2HMA治疗后MDS患者外周血T淋巴细胞上PD-1表达(表4/图3)<br>　　MDS患者HMA治疗后外周血CD3+CD4+T淋巴细胞上PD-1平均表达值为（15.61±5.63)%、CD3+CD8+T淋巴细胞上PD-1平均表达值为（16.33±6.28）%，高于对照组及治疗前（P=0.00）。<br>　　3.FCM检测HMA治疗前后MDS患者骨髓单个核细胞上PD-L1表达变化：<br>　　3.1HMA治疗前MDS患者骨髓单个核细胞上PD-L1表达(表3/图3)<br>　　MDS患者骨髓单个核细胞上PD-L1平均表达值为（7.45±2.98）%，与正常对照组比无差别（Pgt;0.05）。<br>　　3.2HMA治疗后MDS患者骨髓单个核细胞上PD-L1表达(表4/图3)<br>　　MDS患者HMA治疗后骨髓单个核细胞上PD-L1平均表达值为（16.48±6.64）%，显著高于对照组及治疗前（P=0.00）。<br>　　4.RT-PCR检测HMA治疗前后MDS患者外周血及骨髓单个核细胞上PD-1mRNA/PD-L1mRNA表达变化<br>　　4.1HMA治疗前MDS患者外周血单个核细胞上PD-1mRNA及骨髓单个核细胞上PD-L1mRNA相对表达(表5)<br>　　MDS患者外周血单个核细胞上PD-1mRNA相对表达量为（2.80±1.94），高于正常对照组（P=0.04）；骨髓单个核细胞上PD-L1mRNA相对表达，与正常对照组相比无差别（Pgt;0.05）。<br>　　4.2.HMA治疗后MDS患者外周血单个核细胞上PD-1mRNA及骨髓单个核细胞上PD-L1mRNA表达(表5/图4)<br>　　MDS患者HMA治疗后外周血单个核细胞上PD-1mRNA相对表达量为（10.60±5.89），骨髓单个核细胞上PD-L1mRNA表达表达量为（6.5±4.36）,显著高于正常对照组及治疗前（P=0.00）。<br>　　5.HMA治疗后MDS患者淋巴细胞比例变化与预后关系，PD1/PD-L1表达变化对HMA疗效的影响<br>　　5.1HMA对淋巴细胞比例的变化和预后关系(表6/图6)<br>　　有效组/无效组：HMA治疗后MDS患者无效组外周血CD3+CD4+T淋巴细胞比例为（30.53±6.86)%、CD4+/CD8+比值为（0.98±0.31），均显著低于有效组(P=0.01、0.00)；而CD3+CD8+T淋巴细胞比例为（31.17±4.82）%、Treg细胞比例为（4.03±2.27）%，均显著高于有效组（P=0.04、0.03）。B淋巴细胞、NK细胞比例，与有效组比无差异（Pgt;0.05）。<br>　　5.2FCM检测PD-1/PD-L1表达变化和HMA疗效的关系(表7、8/图7、8)<br>　　有效组/无效组：MDS患者HMA治疗后无效组外周血CD3+CD4+T淋巴细胞上PD-1表达值为（20.13±4.25)%、CD3+CD8+T淋巴细胞上PD-1表达值为（19.59±6.49）%、骨髓单个核细胞上PD-L1平均表达值为（19.91±4.88）%，均高于有效组（P=0.01），并且随着疗效的降低PD-1/PD-L1表达绝对值逐渐升高。<br>　　5.3RT-PCR检测骨髓单个核细胞上PD-L1mRNA表达变化和HMA疗效的关系(表9、10/图9、10)<br>　　有效组/无效组：MDS患者HMA治疗后无效组骨髓单个核细胞上PD-L1mRNA表达表达量为（8.97±2.58）,显著高于有效组（P=0.00），随着疗效的降低PD-L1mRNA相对表达量绝对值逐渐升高。<br>　　结论：<br>　　1.MDS患者外周血T淋巴细胞亚群失调，CD4+辅助T淋巴细胞减少，而CD8+细胞毒性T淋巴细胞与Treg细胞数升高，CD4+/CD8+比例倒置，B细胞及NK细胞无明显差异，提示MDS患者存在免疫功能紊乱。经HMA治疗后免疫细胞部分恢复，以辅助性T淋巴细胞恢复为主，而Treg细胞比例降低，这可能与肿瘤免疫逃逸机制相关。<br>　　2.MDS患者外周血T淋巴细胞上PD-1表达升高，而骨髓单个核细胞PD-L1表达与正常人无差别，经HMA治疗后PD-1/PD-L1表达均显著升高，并且随着疗效的降低，MDS患者PD-1/PD-L1平均表达绝对值升高，HMA治疗无效组PD-1/PD-L1表达显著高于有效组，提示PD-1/PD-L1可能与HMA耐药机制密切相关。<br>　　3.MDS患者外周血单个核细胞上PD-1mRNA相对表达量高于正常人，而骨髓单个核细胞上PD-L1mRNA与正常人无差别，经HMA治疗后PD-1mRNA/PD-L1mRNA相对表达量均显著升高，同样随着疗效的降低，骨髓单个核细胞上PD-L1mRNA相对表达绝对值升高，HMA治疗无效组PD-L1mRNA相对表达量显著高于有效组，进一步证明HMA治疗后PD-1/PD-L1升高，可能介导HMA耐药反应，提示预后不良。<br>　　4.综上，HMA在MDS的治疗前后影响免疫细胞的比例发生变化，CD4+的辅助T细胞的比例上升，Treg的下调有助于对肿瘤细胞的清除，但是HMA又通过提高淋巴细胞上PD-1的表达，对T细胞功能发挥作用产生抑制作用，过度增高的PD-1表达会导致HMA的疗效欠佳，这可能是HMA发生耐药的机制之一。