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摘要L-亮氨酸与L-异亮氨酸、L-缬氨酸，合称为支链氨基酸，是哺乳动物体内无法合成的八种必需氨基酸之一。其广泛应用于调味品、饲料添加剂、化妆品和药品等领域。微生物发酵法是工业化生产L-亮氨酸的主要方法。菌种的选育和发酵过程控制是发酵生产L-亮氨酸的核心环节。随着对L-亮氨酸合成途径和相关反馈机制的深入了解，理性代谢工程技术已广泛应用于开发高性能的L-亮氨酸生产菌。然而目前开发的L-亮氨酸生产菌，应用到工业化生产的案例鲜有报道，多数停留在实验阶段。实际上，从微生物育种到生产实践应用，存在大量亟待解决的问题。为此，本研究以一株工业化生产L-亮氨酸菌株CorynebacteriumglutamicumCP为研究对象，对其进行理性代谢工程改造，并研究了多种发酵工艺对其生产L-亮氨酸的影响，最后对发酵工艺放大，L-亮氨酸的分离纯化进行了研究。主要研究内容和结果如下：<br>　　（1）对生产菌进行代谢工程改造，提升了工程菌的底物利用率，降低了副产物的生产。丙酮酸和乙酰辅酶A是合成L-亮氨酸的主要前体物。在工程菌引入来源B.adolescentis的突变体磷酸转酮酶，优化了其转录表达强度，提高了单位葡萄糖生产乙酰辅酶A的能力，然后对竞争代谢途径的基因进行了转录弱化和敲除，提高了L-亮氨酸的产量，减少了副产物L-丙氨酸的生成。最终获得的菌株C.glutamicumCP04(ΔltbR::Ptuf-fxpkΔPgltA::PdapA)，摇瓶发酵L-亮氨酸产量为25.2g/L。<br>　　（2）研究了多种发酵工艺对工程菌C.glutamicumCP04生产L-亮氨酸的影响。在补料分批发酵中，接种量为20%时，培养基生物素浓度为50μg/L，L-亮氨酸产量为53.0g/L，副产物L-丙氨酸浓度为6.4g/L。采用超声辅助发酵工艺生产L-亮氨酸，经优化得到最适的超声参数组合为超声功率密度为94W/L，超声频率为25kHz，超声间隔为31min，超声持续时间为37s。L-亮氨酸产量为64.1g/L，较补料分批发酵提高了20.9%。超声辅助发酵下，细胞形态无明显变化，细胞膜通透性和酶活性显著提高。为解决补料分批发酵存在的问题，采用过程强化工艺，培养C.glutamicumCP04生产L-亮氨酸。采用细胞循环重复分批发酵工艺，L-亮氨酸的平均产量为26.5g/L，而副产物L-丙氨酸的平均产量为0.87g/L。与补料分批发酵相比，糖酸转化率和产率分别提高16.2%、48.3%。采用细胞循环连续发酵工艺，稳态时L-亮氨酸的浓度为21.3g/L，副产物L-丙氨酸浓度为0.5g/L。与补料分批发酵相比，糖酸转化率和产率分别提高18.3%、60.8%。采用恒化培养工艺，稀释率为0.04h-1，流加培养基添加1.2g/L乙酸铵，稳态时L-亮氨酸浓度为24.8g/L，L-丙氨酸浓度为0.8g/L，糖酸转化率和产率分别提高10.2%、35.0%。综合考虑，选择细胞循环重复分批发酵进行工艺放大研究。<br>　　（3）在优化小试发酵工艺条件下，在5m3罐水平进行中试发酵放大工艺研究。与小试发酵相比，中试发酵L-亮氨酸产量下降，副产物L-丙氨酸积累较多。将直叶搅拌桨更换为斜叶搅拌桨，提高了混合效率，泡沫一定程度减少，菌体浓度、L-亮氨酸的产量、糖酸转化率较改进前分别提高了14.5%、12.0%、8.2%，而副产物L-丙氨酸产量下降12.5%。在5m3罐进行细胞循环重复分批发酵研究表明，L-亮氨酸的平均产量为24.4g/L，L-丙氨酸产量平均为0.9g/L，与补料分批发酵工艺相比，产率与转化率分别提高了45.4%、5.6%。<br>　　（4）比较了离子交换层析和电渗析分离纯化工艺的差异。超滤处理细胞循环发酵液时，平均膜通量为24.5L/m2/h，滤液的脱色率为58.6%，回收率为87.4%。优化离子交换层析工艺，L-亮氨酸回收率为91.2%。优化电渗析纯化工艺，L-亮氨酸浓度、回收率及纯度分别为16.2g/L、95.6%、96.3%。确定了活性炭脱色的最短处理时间为20min，最适处理温度为55℃。离子交换层析纯化工艺所需活性炭为0.5g/L，而电渗析纯化工艺只需0.3g/L。浓缩结晶后，离子交换层析工艺纯化L-亮氨酸的回收率和纯度分别为76.8%、95.6%，而电渗析工艺纯化的L-亮氨酸回收率和纯度分别为87.6%、98.7%。