检索历史 清除

摘要背景和目的<br>　　慢性肝病（Chronicliverdisease，CLD）可导致肝外多脏器功能损害（心脏、肺脏、肾脏、大脑等）。越来越多的证据表明，CLD时血管扩张剂和促血管生成因子明显增加，从而在多个脏器出现异常血管新生现象。这些病理性血管新生与其脏器功能损害密切相关，提示这些脏器共同出现的“肝外病理性血管新生（Extrahepaticpathologicalangiogenesis，EPA）”可能是CLD多器官功能损害的共同病理机制之一，针对其深入研究是CLD患者多器官功能损害的防治新策略。<br>　　既往文献报道病理性肺血管新生是肝肺综合征（Hepatopulmonarysyndrome，HPS）的重要原因，已成为干预研究新靶点。国外有团队报道胆总管结扎（Commonbileductligation，CBDL）大鼠模型在肠道亦出现EPA现象，本课题在研究中亦意外地发现大脑皮层、肾脏、肠道中亦可能存在肝外血管生成，并可能与肝外脏器功能损害有关，值得深入研究。因此，本研究目的是在CBDL大鼠模型中探讨：1.肝外器官(如肺、肾、脑、肠等)是否存在血管生成并伴有功能损害；2.血管内皮生长因子（Vascularendothelialgrowthfactor,VEGF）家族是否介导CLD的EPA；3.A3腺苷受体（A3adenosinereceptor，A3R）是否介导大脑皮层EPA的形成。<br>　　材料和方法<br>　　本研究首先建立CBDL大鼠模型，通过免疫荧光染色血管，定量微血管密度（Microvasculardensity,MVD），比较各个器官MVD的变化情况。然后检测血清和各个脏器（肝脏、肺脏、脑、脾脏、小肠和肾脏）VEGF家族血管因子含量变化。分析MVD和VEGF家族血管因子之间的关系。最后证明A3R是否介导CBDL大鼠脑皮质血管生成。具体实验如下：<br>　　1.实验一：构建CBDL大鼠模型。将SD大鼠分为假手术组（Sham组）和CBDL术后5周组（CBDL5w组）。取材后，检测血气、血清学和尿液指标，并且观察各脏器（肝脏、肺脏、脑、脾脏、小肠和肾脏）形态学表现，并进行脏器损伤程度评分。<br>　　2.实验二：免疫荧光染色评估CBDL大鼠各脏器血管生成情况，并且使用Elisa试剂盒测定血清和各个脏器（肝脏、肺脏、脑、脾脏、小肠和肾脏）VEGF家族因子(VEGF、VEGFR1、VEGFR2、sFlt-1和PLGF)的含量。<br>　　3.实验三：免疫荧光染色检测A3R在CBDL大鼠脑组织的定位和相对表达量，qPCR和Westernblot检测大脑皮层血管内皮增殖、迁移相关信号通路蛋白（A3R、VEGF、FAK和Src）的变化。伊文思蓝（Evansblue，EB）染料定量检测大鼠血脑屏障（BloodBrainBarrier,BBB）通透性的改变情况。水迷宫实验检验大鼠行为学的改变情况。<br>　　结果<br>　　1.CBDL大鼠5周后均出现黄疸、腹水。CBDL5w组谷丙转氨酶（Alanineaminotransferase，ALT）、谷草转氨酶（Aspartateaminotransferase，AST）、总胆红素（Totalbilirubin，TB）和碱性磷酸酶（Alkalinephosphatase，ALP）均高于Sham组（P＜0.001），说明肝功能显著受损。CBDL5w组肝脏大体观胆管扩张，胆汁淤积，肝脏质地硬化表面不平形成小结节，天狼猩红染色也观察到肝纤维化明显，说明肝硬化模型成功。HPS是肝硬化的一种并发症，主要表现为氧合障碍。CBDL5w组PaO2下降（P＜0.001）和P（A-a）O2增加（P＜0.001），而且CBDL5w组肺脏斑点状改变，有部分坏死病灶，苏木素-伊红染色显示严重肺泡紊乱，炎症细胞浸润明显，肺微血管扩张，说明成功复制出HPS的典型改变。以上提示成功建立了CBDL大鼠模型。<br>　　2.除了上述肝和肺损伤之外，苏木素-伊红染色显示相对Sham组，CBDL5w组大鼠1）脑组织神经元损伤和凝固性坏死，并且正常神经元数目减少(P＜0.001)；2）小肠绒毛排列杂乱无章，从高柱状变为矮宽状，绒毛内扩张充血的红细胞增多(P＜0.001)；3）肾小管扩张，肾脏指数增加（P＜0.05）；检测肾功能相关指标，发现除了24h尿量没有统计学意义，其他指标与Sham组的差异均有统计学意义，其中钠离子浓度、肌酐、尿素氮在血清和尿液中变化一致。相对于Sham组，CBDL5w组钠离子浓度下降，肌酐、尿素氮均增加(P＜0.01)。CBDL5w组24h蛋白也增加(P＜0.01)。提示肾脏功能损伤的胱抑素C（Cys-c）在CBDL5w组也增加(P＜0.01)。提示CBDL大鼠肝外多脏器损害。<br>　　3.CBDL5w组肠系膜窗血管新生杂乱无章，尖端变细，数量增多(P＜0.001)。免疫荧光染色血管标记物（CD31）发现与Sham组相比，CBDL5w组除脾脏外，肝脏、肺脏、脑皮质、小肠和肾脏CD31染色均增加。而且计数各脏器MVD也增加(P＜0.001)。血清和各个脏器VEGF家族因子（VEGF、VEGFR1、VEGFR2、sFlt-1）变化不一致，可能与各个脏器MVD含量有关。提示CBDL大鼠肝外病理性血管生成和体内血清中VEGF家族改变直接相关。<br>　　4.免疫荧光染色显示大量A3R聚集在皮质血管周围。相对于Sham组，CBDL5w组A3R、VEGF、FAK、Src的mRNA表达量上调(P＜0.01)，并且A3R、VEGF、p-FAK、p-Src蛋白表达均增加(P＜0.01)，说明A3R通过经典的VEGF/FAK/Src通路促进血管内皮迁移和增殖，从而发生血管新生。通透性检测也发现CBDL大鼠大脑皮层EB含量增加(P＜0.01)，提示大脑通透性明显改变。水迷宫实验发现CBDL大鼠学习和记忆能力下降(P＜0.05)。<br>　　结论<br>　　1.成功建立了实验性HPS大鼠模型。<br>　　2.HPS大鼠肝外多脏器病理改变提示脏器损害；同时存在肝外病理性血管生成，并且和VEGF家族相关。<br>　　3.A3R通过激活VEGF/FAK/Src通路促进HPS大鼠大脑皮层血管生成，并伴有血脑屏障通透性的破坏和认知功能障碍。