Siglec-9配体参与血小板自稳状态维持及其在缺氧导致血小板异常活化中的作用-论文-万方医学网

Siglec-9配体参与血小板自稳状态维持及其在缺氧导致血小板异常活化中的作用

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摘要高原地区的特殊环境能够影响平原移居人群的凝血功能，凝血功能异常与血小板的数量和功能异常密切相关，血小板功能异常会导致严重后果，故维持其“自稳”状态具有重要的生理学意义。现有研究发现，在血小板活化过程中，不同刺激因素能通过各自信号通路引起血小板活化聚集，但对于正常条件下，维持其“自稳”状态的抑制性信号通路研究尚不够深入。 　　表达于免疫细胞的唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素家族Siglec（Sialic-acid-binding Immunoglobulin-like Lectin）是能与唾液酸末端的聚糖结构特异性结合的一类细胞膜蛋白，属于凝集素家族。Siglec-9（人源，小鼠同系物为Siglec-E）主要表达于单核/巨噬细胞和中性粒细胞等，激活后通过募集含有Src同源区2结构域的磷酸酶（Src homology region2domain-containing phosphatases，SHP）-1和SHP-2，从而发挥抑制炎症反应的作用。最近有研究证实血小板表面亦有Siglec9/E表达，但尚未见其在血小板保持“自稳”中作用的报道。 　　现有研究证实Siglec-9与特定配体结合后可发挥抑制炎症细胞活性的生物学作用，且其配体的重要特征是具有Lewis-X聚糖结构，在不同组织中可表现为不同糖蛋白或者糖脂等。但目前暂无血小板中存在Siglec-9配体的相关研究。本研究拟对血小板中Siglec-9配体的表达、结合方式进行初步研究，探讨Siglec-9以及配体在维持血小板静态平衡中的作用；探讨缺氧是否对该聚糖配体的表达产生影响进而诱发血小板异常活化，进而为高原缺氧导致血栓性疾病的防治提供新的实验依据。 　　方法： 　　1血小板上Siglec-9配体的表征 　　1.1血小板分离得到亲水和疏水蛋白，采用Western Blot方法，检测Siglec-9配体；并用流式细胞术检测血小板膜上Siglec-9配体的表达。 　　1.2使用PNGase F、O-糖苷酶、α2-3唾液酸酶、α2-3,6,8唾液酸酶处理获取的血小板总蛋白，使用Western Blot明确Siglec-9配体的末端糖型结构；MALⅡ、SNA流式细胞术进一步鉴定血小板Siglec-9配体的末端唾液酸连接方式。 　　1.3Siglec-9Fc免疫共沉淀确定目的蛋白的分子量，并鉴定该配体的蛋白种类。细胞免疫荧光分析Siglec-9配体和CD42b共定位。 　　1.4流式细胞术测定中、晚期巨核细胞Siglec-9配体表达。 　　1.5利用工具NetOGlyc-4.0分析CD42b的糖基化位点，并用真核系统HEK293F合成CD42b片段确定Siglec-9结合位点。 　　2血小板上蛋白载体结合方式以及在维持血小板稳态平衡中的作用 　　2.1流式细胞术测定血小板表达Siglec-9/E。 　　2.2洗涤血小板，加入NSC-87877室温孵育1h，流式细胞术测定ADP、胶原和凝血酶刺激后血小板活化标记物CD62p的表达水平，统计其平均荧光强度值。 　　2.3动物实验分组：实验组：髓系Siglec-E基因敲除小鼠（Lyz2-cre：Siglec-Eflox/flox，n=3）；对照组：C57BL/6小鼠（n=3），流式细胞术测定ADP、胶原和凝血酶刺激后血小板活化标记物CD62p的表达水平，统计其平均荧光强度值。 　　2.4洗涤血小板，加入Anti-siglec-9、Anti-CD42b以及GT1b室温孵育1h,流式细胞术测定ADP、胶原和凝血酶刺激后血小板CD62p的表达水平，统计其平均荧光强度值。 　　2.5洗涤血小板，经α2-3唾液酸酶、α2-3,6,8唾液酸酶处理，流式细胞术测定Siglec-9配体的表达，并测定血小板CD62p的表达水平，统计其平均荧光强度值。 　　2.6共培养测定血小板Siglec-9与配体结合方式：THP-1细胞加入100μg/L PMA刺激分化48h，对细胞进行以下处理（n=3）：对照组、血小板组、序列1和GT1b培养1h；收集细胞总蛋白。免疫共沉淀及Western Blot测定THP-1的SHP-1蛋白水平表达。 　　2.7各种刺激剂对血小板配体表达变化的影响 　　2.7.1取新鲜血液，以1∶10体积的柠檬酸钠溶液抗凝，按上述方法提取洗涤血小板，4mg/ml Glc（葡萄糖）、Gal（半乳糖）、Mannose（甘露糖）、N-乙酰葡萄糖胺、Neu5Ac（唾液酸）、蔗糖孵育血小板24h，流式细胞术测定配体表达水平的变化。 　　2.7.2取新鲜血液，以1∶10体积的柠檬酸钠溶液抗凝，按上述方法提取洗涤血小板，2.6mg/mL、4mg/mL、6mg/mL、9mg/mL Glc（葡萄糖）孵育血小板24h，流式细胞术测定配体变化表达水平的变化。 　　3缺氧下调血小板表面Siglec-9聚糖配体并导致血小板功能异常活化 　　3.1实验动物分组：动物分为4组，每组6只，分别为对照3d组、缺氧3d组、对照7d组和缺氧7d组。对血小板进行计数并用流式细胞术测定血小板Siglec-E本身和配体表达以及ADP、胶原和凝血酶刺激后血小板CD62p的表达水平，统计其平均荧光强度值。 　　3.2取新鲜血液制备洗涤血小板，分组：1)对照组；2)缺氧组；3)GT1b组；4)奥司他韦组；用流式细胞术测定血小板Siglec-9本身和配体表达以及ADP、胶原和凝血酶刺激后血小板CD62p，统计其平均荧光强度值。 　　3.3Western blot测定血小板糖基转移酶（ST3GAL3、ppGalNAc T、GALE）表达水平并用流式细胞术测定神经氨酸酶1（NEU1）表达。 　　结果： 　　1.血小板上Siglec-9配体的表征 　　Siglec-9配体主要表达在血小板细胞膜，该配体是末端结构为α2-3连接的唾液酸糖蛋白，且血小板上Siglec-9配体蛋白载体是CD42b的黏蛋白区（Mucin Like Region,MLR）。 　　2.血小板上Siglec-9及其蛋白载体在维持血小板稳态平衡中的作用 　　2.1使用NSC-87877(SHP-1抑制剂)、anti-siglec-9、anti-CD42b以及Siglec-E髓系敲除小鼠后Siglec-9/E活性被抑制从而使血小板活化增强。 　　2.2血小板与THP-1共孵育测定SHP-1无变化，推测Siglec-9与配体顺式结合。 　　2.3与Control组相比，葡萄糖、半乳糖、N-乙酰葡萄糖胺和蔗糖组血小板Siglec-9配体的表达均显著性上调。 　　3.缺氧下调血小板表面Siglec-9聚糖配体导致血小板功能异常活化 　　3.1缺氧处理显著降低小鼠血小板Siglec-E聚糖配体水平，增加血小板活化。 　　3.2缺氧导致培养血小板Siglec-9配体表达水平显著降低，增加血小板活化。 　　3.3缺氧通过激活NEU1降低Siglec-9/E聚糖配体表达，神经氨酸酶抑制剂能够阻断缺氧导致的Siglec-9配体表达降低。 　　结论： 　　1.血小板细胞膜广泛存在Siglec-9聚糖配体表达。 　　2.该配体是末端结构为α2-3连接的唾液酸糖蛋白，且血小板上Siglec-9蛋白载体是CD42b的黏蛋白区（Mucin Like Region,MLR）。 　　3.血小板Siglec-9与配体顺式结合后发挥抑制血小板活化的作用。 　　4.缺氧导致血小板异常活化的机制与该配体表达变化相关，提示Siglec-9配体可能是干预高原缺氧导致血栓性疾病防治的新靶点。