检索历史 清除

摘要目的<br>　　构建小鼠脓毒血症盲肠结扎穿孔（cecalligationandpuncture，CLP）模型及脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的H9C2心肌细胞损伤模型，探讨线粒体乙醛脱氢酶2（aldehydedehydrogenase2，ALDH2）是否通过抑制caspase-11介导的非经典途径细胞焦亡对脓毒血症性心肌损伤发挥保护作用。<br>　　方法<br>　　一、动物实验<br>　　SPF级C57BL/6J雄性小鼠随机分为4组：假手术组（Sham）、CLP组、CLP+Alda-1（ALDH2特异性激动剂）组、Sham+二甲基亚砜（DMSO,Alda-1药物溶剂）组。CLP组小鼠术前12h禁食不禁水；CLP+Alda-1组小鼠术前1h腹腔注射10mg/kgAlda-1；DMSO+Sham组腹腔注射10mg/kgDMSO。<br>　　造模24h后，超声心动图评估小鼠心功能变化；HE染色观察心肌组织病理变化；透射电镜观察心肌超微结构变化；酶联免疫吸附法（enzyme-linkedimmunosorbentassays,ELISA）检测心肌组织炎性因子肿瘤坏死因子α（tumornecrosisfactor,TNF-α）的表达变化；蛋白免疫印迹法（westernblotting,WB）检测心肌caspase-11、GSDMD、HMGB1及RAGE蛋白表达变化；免疫共沉淀（co-immunoprecipitation,CO-IP）探讨ALDH2与非经典焦亡相关各蛋白的关系。<br>　　二、细胞实验<br>　　利用腺病毒感染心肌细胞，构建ALDH2基因稳定过表达的细胞株；以LPS浓度为300μg/ml干预心肌细胞建立脓毒血症心肌损伤模型。心肌细胞随机分为4组：正常对照组（normalgroup,NG）、LPS损伤组（LPS）、LPS+ALDH2基因过表达组（LPS+ALDH2-GFP）、LPS+病毒空载对照组（LPS+GFP）。<br>　　分组干预心肌细胞24h后，CCK-8法测定细胞活性；分光光度法检测细胞培养液上清中乳酸脱氢酶（lactatedehydrogenase，LDH）水平；免疫荧光技术（immunofluorescence，IF）与蛋白免疫印迹法（westernblotting,WB）检测各组caspase-11、GSDMD、HMGB1及RAGE蛋白表达变化。<br>　　结果<br>　　一、动物实验<br>　　与Sham组相比，CLP组小鼠左室射血分数（leftventricularejectionfraction,LVEF）、左室短缩分数（leftventricularfractionalshortening,LVFS）、每搏输出量（strokevolume,SV）均明显降低（P＜0.01），左室收缩末期内径（leftventricularend-systolicinternaldiameter,LVESD）明显升高（P＜0.01）；心肌组织出现血管轻微扩张、间质红细胞外渗、炎性细胞浸润、细胞质空泡化；心肌纤维断裂、线粒体排列不规则且紊乱，一些线粒体肿胀，膜破裂，线粒体嵴破坏；心肌炎性因子TNF-α表达增多（P＜0.05）；非经典焦亡相关蛋白caspase-11（P＜0.01）、GSDMD（P＜0.05）、HMGB1（P＜0.01）及RAGE（P＜0.01）表达均增多。<br>　　与CLP组相比，CLP+Alda-1组小鼠LVEF、LVFS、SV显著上升（P＜0.01），LVESD显著降低（P＜0.01）；心肌组织基本未见血管扩张、炎性细胞浸润、细胞质空泡化等病理表现；心肌纤维排列相对规整，线粒体明显修复；炎性因子TNF-α表达降低（P＜0.05）；非经典焦亡相关蛋白caspase-11（P＜0.01）、GSDMD（P＜0.05）、HMGB1（P＜0.01）及RAGE（P＜0.01）表达均降低。<br>　　与Sham组相比，DMSO+Sham组各指标均无明显差异。<br>　　CO-IP结果显示，以ALDH2为诱饵蛋白下拉的总蛋白中可检测到HMGB1、RAGE及GSDMD蛋白，而caspase-11蛋白未被检测到。<br>　　二、细胞实验<br>　　与NG组相比，LPS组心肌细胞活性明显上升（P＜0.01）；LDH水平明显上升（P＜0.01）；westernblotting显示非经典焦亡相关蛋白caspase-11（P＜0.05）、GSDMD、HMGB1及RAGE（P＜0.01）蛋白表达均明显增多；免疫荧光显示caspase-11、GSDMD、HMGB1及RAGE（P＜0.01）蛋白表达均明显增多。<br>　　与LPS组相比，LPS+ALDH2-GFP组细胞活性明显降低（P＜0.01）；LDH水平明显降低（P＜0.01）；westernblotting显示非经典焦亡相关蛋白caspase-11（P＜0.05）、GSDMD（P＜0.01）、HMGB1（P＜0.05）及RAGE（P＜0.05）均明显降低；免疫荧光显示caspase-11、GSDMD（P＜0.01）、HMGB1及RAGE（P＜0.05）蛋白表达均明显降低。<br>　　与LPS组相比，LPS+GFP组各指标均无明显差异。<br>　　结论<br>　　ALDH2对LPS引起的脓毒血症性心肌损伤具有保护作用，可能通过抑制caspase-11介导的非经典途径细胞焦亡减轻心肌损伤；ALDH2可直接作用于HMGB1、RAGE及焦亡执行蛋白GSDMD发挥作用。