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摘要目的：肝纤维化是病毒性肝炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪肝炎、自身免疫性肝病等各种慢性肝病引起的细胞外基质（extracellularmatrix,ECM）异常积聚导致的伤口愈合反应，这一过程可以造成肝脏结构和功能的损伤。如果肝纤维化高度进展，可发展为肝硬化，甚至肝细胞癌。尽管目前已有抗肝纤维化的药物，但肝纤维化的发生发展机制并不完全清楚。因此，了解肝纤维化的发生发展机制对干预肝纤维化进程、预防肝细胞癌的发生具有重要意义。在肝纤维化发生发展过程中，肝星形细胞（hepaticstellatecells,HSCs）的激活是中心驱动因素，活化的HSCs促进ECM的积累。在肝脏丰富的细胞环境中，肝实质细胞和非实质细胞共同调控HSCs的激活和肝纤维化的形成和消退。其中，受损的肝细胞是肝纤维化的“启动子”，通过释放各种化合物，如活性氧、细胞因子、趋化因子和生长因子等参与HSCs的激活和维持。但肝细胞具体如何调节肝纤维化的进程尚不完全清楚。Smamotheragainstdecapentaplegichomolo4（Smad4）是肝纤维化发生发展过程中转化生长因子-β的关键细胞内转录中介物。研究表明，在肝纤维化的发生发展过程中，肝脏中Smad4基因表达明显上调。然而，肝细胞中的Smad4在纤维化发展中的作用尚不明确。因此，本研究构建了肝细胞中特异性敲除Smad4基因的小鼠，探究了肝细胞中Smad4基因在CCl4诱导的肝纤维化的发生发展中的作用及其分子机制。<br>　　方法：利用6-8周龄的雄性C57BL/6小鼠构建CCl4诱导的肝纤维化模型，采用Westernblot以及免疫荧光双染法检测小鼠肝脏中以及肝细胞中Smad4的表达情况。应用肝细胞中特异性敲除Smad4基因的小鼠模型，通过Hamp;E染色、流式细胞分析法检测肝脏炎症以及免疫细胞浸润情况，SiriusRed染色和免疫荧光染色法检测肝脏胶原沉积情况，Westernblot和RT-qPCR法检测小鼠肝组织中纤维化相关基因的表达。以AML-12细胞作为细胞模型，通过免疫荧光、MTT以及划痕实验法检测肝细胞的增殖和迁移，通过Westernblot检测肝细胞上皮间质转化（epithelial-mesenchymaltransition，EMT）。通过肝纤维化组织RNA测序筛选出Smad4基因敲除前后差异显著的关键分子Id1（inhibitorofdifferentiation1）基因，利用si-Smad4小干扰RNA敲低肝细胞中的Smad4，Westernblot和RT-qPCR法检测肝细胞中ID1以及上游正反馈作用相关因子CTGF（connectivetissuegrowthfactor）的表达。利用外源重组CTGF蛋白刺激HSCs细胞系LX-2细胞，Westernblot法检测LX-2细胞中α-SMA的表达及p38、p65的磷酸化水平，探究调控肝纤维化的相关分子机制。<br>　　结果：Westernblot和免疫荧光染色结果显示，Smad4在肝纤维化小鼠肝脏组织以及肝细胞中的表达均显著上调。鼠尾基因PCR鉴定以及原代肝细胞的免疫荧光双染结果表明，肝细胞中Smad4基因被成功敲除。Hamp;E染色和肝脏淋巴细胞流式分析显示，肝细胞中敲除Smad4减少了肝脏炎症以及免疫细胞浸润。SiriusRed染色及免疫荧光染色结果表明，在肝细胞中特异性敲除Smad4基因减轻了肝脏组织中的胶原沉积。RT-qPCR及Westernblot结果进一步证明，肝细胞缺失Smad4降低了肝脏组织中纤维化相关基因的表达。免疫荧光染色、MTT和划痕实验结果发现，肝细胞中Smad4基因的缺失抑制了肝纤维化过程中肝细胞的增殖和迁移。此外，通过Westernblot检测了肝纤维化组织以及肝细胞AML-12的EMT，结果显示，肝细胞缺失Smad4基因抑制了肝细胞中上皮标志物E-cadherin的下调，从而抑制了EMT。通过肝纤维化组织RNA测序及其相关文献的查阅，筛选出关键分子Id1及其正反馈作用相关基因Ctgf。通过Westernblot和RT-qPCR进一步探究了肝细胞来源的CTGF对HSCs激活的机制，结果显示，外源性CTGF蛋白以EGFR（epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR）受体依赖的方式促进了HSCs中p38和p65的磷酸化以及HSCs活化，进而影响了肝纤维化进程。<br>　　结论：本论文的完成明确了肝细胞中Smad4分子在CCl4诱导的肝纤维化中具有促进作用，该促进作用是通过Smad4上调肝细胞中ID1的表达，进而增强CTGF的旁分泌活性来实现的。肝细胞来源的CTGF通过HSCs上EGFR的介导，激活HSCs中p38和p65信号通路，促进了HSCs活化后ECM的积累，进而促进肝纤维化的进程。因此，Smad4可以作为肝纤维化预防和靶向治疗的潜在候选靶点。