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摘要外阴阴道假丝酵母菌病（Vulvovaginalcandidiasis，VVC），即念珠菌阴道炎，主要由念珠菌诱发的粘膜炎症性疾病，对广大女性生活造成困扰。抗真菌化学药物治疗VVC面临严峻挑战，如口服给药不良反应率高、副作用明显、易复发、出现耐药及交叉耐药菌株。新一代抗真菌药物研发缓慢，寻找抗真菌新靶点药物任重道远。中药外治VVC有丰富的临床经验，其疗效确切，具有副作用低、诱导耐药性低、价格低廉、适合长期及预防性使用等特点，其成药具有良好的临床价值和市场前景。<br>　　目的：<br>　　近年来课题组立足临床验方成药性研究，对治疗VVC的临床验方抗白念（Kangbainian，KBN）洗剂开展了持续研究。课题组已证实KBN洗剂对敏感白色念珠菌（Candidaalbicans，C.albicans）具有较好抑菌作用，对定植敏感白色念珠菌的VVC模型小鼠显示良好药效。KBN洗剂对耐药白色念珠菌及其诱导的VVC模型动物是否有作用，其作用机制如何，需要进一步深入研究。因此，本课题拟以体外-体内实验，探讨如上科学问题，为KBN洗剂治疗难治性VVC提供科学实验依据。<br>　　方法：<br>　　1KBN洗剂体外抗耐药白色念珠菌的作用及机制研究<br>　　1.1KBN洗剂对耐药白色念珠菌的抗菌活性研究<br>　　通过体外抗真菌药敏实验，测定KBN洗剂对敏感和耐药白色念珠菌的最低抑菌浓度（Minimuminhibitoryconcentration，MIC）；通过时间-杀伤曲线实验，动态监测KBN洗剂对敏感和耐药白色念珠菌的抗菌活性；通过灭菌时间实验，探讨KBN洗剂浓度与杀灭敏感和耐药白色念珠菌时间的关系。<br>　　1.2KBN洗剂对耐药白色念珠菌生物膜、菌丝和粘附性的影响<br>　　通过XTT实验，检测KBN洗剂对敏感和耐药白色念珠菌早期生物膜形成和成熟生物膜的影响；通过菌丝生长实验，考察KBN洗剂对敏感和耐药白色念珠菌菌丝生长的影响；通过卡尔科弗卢尔荧光增白剂（Calcofluorwhitestain，CFW）染色实验，荧光显微镜下观察KBN洗剂对敏感和耐药白色念珠菌粘附非生物表面、人阴道上皮细胞（VK2/E6E7）和人宫颈癌细胞（Hela）的影响。<br>　　1.3KBN洗剂对耐药白色念珠菌麦角固醇合成及其相关基因ERG11表达水平的影响<br>　　通过高效液相色谱法（High-performanceliquidchromatography，HPLC）实验，检测KBN洗剂对耐药白色念珠菌麦角固醇合成的影响；通过反转录聚合酶链式反应（Reversetranscription-polymerasechainreaction，RT-PCR）实验，检测KBN洗剂对耐药白色念珠菌ERG11基因表达水平的影响。<br>　　1.4KBN洗剂对耐药白色念珠菌药物转运体功能及基因表达水平的影响<br>　　以罗丹明6G/123（Rhodamine6G/123，Rh6G/123）吸收与外排实验，检测KBN洗剂对耐药白色念珠菌药物转运体吸收与外排功能的影响。采用RT-PCR实验，检测KBN洗剂对耐药白色念珠菌CDR1、CDR2和MDR1基因表达水平的影响。<br>　　2KBN洗剂对耐药白色念珠菌致VVC模型动物的体内作用及抗炎机制研究<br>　　2.1KBN洗剂对耐药白色念珠菌致VVC模型小鼠的影响<br>　　通过皮下注射雌激素与阴道定植耐药白色念珠菌901，建立VVC小鼠模型，各组小鼠阴道予以相应药物30μL，给药3周。药效学指标包括：小鼠阴道炎症症状，革兰氏染色法观察小鼠阴道灌洗液中耐药白色念珠菌形态，平板计数法测定小鼠阴道灌洗液中耐药白色念珠菌载荷量，HE、PAS染色法和扫描电镜观察小鼠阴道组织病理学改变。<br>　　2.2KBN洗剂对耐药白色念珠菌致VVC模型大鼠的影响<br>　　通过皮下注射雌激素与阴道定植耐药白色念珠菌901，建立VVC大鼠模型，各组大鼠阴道予以相应药物150μL，给药1周。药效学指标同VVC模型小鼠实验。<br>　　2.3KBN洗剂对耐药白色念珠菌致VVC模型小鼠抗炎机制研究<br>　　通过蛋白印迹（WesternBlot，WB）实验，检测小鼠阴道组织炎症因子（TNF-α、IL-1β和IL-6）、炎症小体NLRP3、树突状细胞相关C型凝集素1（Dendriticcell-associatedC-typelectin-1，Dectin-1）信号通路（Dectin-1、Syk、PLCγ-2、CARD9和NF-κB）蛋白的表达水平。<br>　　3KBN洗剂抗耐药白色念珠菌的药效物质及潜在优势探讨<br>　　3.1KBN洗剂抗耐药白色念珠菌的药效物质<br>　　通过体外抗真菌药敏实验，测定KBN洗剂中单体成分对耐药白色念珠菌的MIC。<br>　　3.2KBN洗剂与唑类药物联合抗耐药白色念珠菌的作用研究<br>　　采用棋盘微量液基稀释法实验，以分级抑菌浓度指数（Fractionalinhibitoryconcentrationindex,FICI）评价KBN洗剂与唑类药物对耐药白色念珠菌的联合抗菌作用。<br>　　3.3KBN洗剂中单体成分间或单体成分/唑类药物联合抗耐药白色念珠菌的作用研究<br>　　采用棋盘微量液基稀释法实验，以FICI评价KBN洗剂中单体成分间或单体成分/唑类药物对耐药白色念珠菌的联合抗菌作用。<br>　　3.4KBN洗剂逆转耐药白色念珠菌对氟康唑耐药性研究<br>　　通过KBN洗剂刺激诱导实验，考察KBN洗剂能否恢复耐药白色念珠菌对氟康唑的敏感性，以及耐药白色念珠菌子代是否对KBN洗剂产生耐药。<br>　　结果：<br>　　1KBN洗剂体外抗耐药白色念珠菌的作用及机制研究<br>　　1.1KBN洗剂对耐药白色念珠菌的抗菌活性研究<br>　　体外抗真菌药敏实验结果显示，耐药白色念珠菌（901、904、311）对氟康唑（MIC＞64μg/mL）、酮康唑（MIC＞8μg/mL）耐药；KBN洗剂对敏感和耐药白色念珠菌具有相同抗菌效果，其MIC均为6.25mg/mL，低于香莲外洗液和洁尔阴洗液。时间-杀伤曲线实验结果显示，KBN洗剂能抑制敏感和耐药白色念珠菌生长，其浓度越高，抗菌效果越好；12.5mg/mLKBN洗剂抗菌效果优于同原液稀释倍数的洁尔阴洗液。灭菌时间实验结果显示，KBN洗剂能杀灭敏感和耐药白色念珠菌，其浓度越高，灭菌时间越短；1.00g/mLKBN洗剂杀灭敏感和耐药白色念珠菌时间（15min）短于洁尔阴洗液原液（360min）。<br>　　1.2KBN洗剂对耐药白色念珠菌生物膜、菌丝和粘附性的影响<br>　　XTT实验结果显示，KBN洗剂显著抑制敏感和耐药白色念珠菌早期生物膜形成，显著破坏其成熟的生物膜。菌丝生长实验结果显示，KBN洗剂能抑制敏感和耐药白色念珠菌菌丝生长。粘附实验结果显示，KBN洗剂能抑制敏感和耐药白色念珠菌对非生物表面、VK2/E6E7细胞和Hela细胞的粘附，并抑制其菌丝生长，在一定程度保护VK2/E6E7细胞。<br>　　1.3KBN洗剂对耐药白色念珠菌麦角固醇合成及其相关基因ERG11表达水平的影响<br>　　HPLC实验结果显示，KBN洗剂显著降低耐药白色念珠菌901麦角固醇合成。RT-PCR实验结果显示，KBN洗剂显著下调耐药白色念珠菌901ERG11基因的表达水平。<br>　　1.4KBN洗剂对耐药白色念珠菌药物转运体功能及基因表达水平的影响<br>　　Rh6G/123吸收实验结果显示，KBN洗剂显著促进耐药白色念珠菌901对Rh6G/123吸收。Rh6G/123外排实验结果显示，耐药白色念珠菌901对Rh6G/123外排量显著高于敏感菌98001，KBN洗剂显著抑制耐药白色念珠菌901对Rh6G/123外排。RT-PCR实验结果显示，耐药白色念珠菌901外排泵基因CDR1、CDR2和MDR1的mRNA表达量显著高于敏感菌98001，KBN洗剂显著抑制耐药白色念珠菌901外排泵基因CDR2和MDR1的过表达水平。<br>　　2KBN洗剂对耐药白色念珠菌致VVC模型动物的体内作用及机制研究<br>　　2.1KBN洗剂对耐药白色念珠菌致VVC模型小鼠的影响<br>　　VVC模型小鼠实验结果显示，KBN洗剂显著改善VVC模型小鼠阴道红肿症状，减少白色分泌物分泌量及腥臭味，显著降低阴道内耐药白色念珠菌载荷量并抑制菌丝形成；阴道组织HE、PAS染色结果显示，KBN洗剂能改善VVC模型小鼠阴道炎症程度、抑制阴道内耐药白色念珠菌生长和菌丝形成；阴道组织扫描电镜结果显示，KBN洗剂能恢复VVC模型小鼠阴道组织内表面的光滑程度，抑制耐药白色念珠菌粘附和菌丝形成。KBN洗剂对VVC模型小鼠药效优于上市药物洁尔阴洗液。<br>　　2.2KBN洗剂对耐药白色念珠菌致VVC模型大鼠的影响<br>　　VVC模型大鼠实验结果显示，KBN洗剂显著改善VVC模型大鼠阴道红肿症状，减少白色分泌物分泌量，显著降低阴道内耐药白色念珠菌载荷量并抑制菌丝形成；阴道组织HE、PAS染色结果显示，KBN洗剂能改善VVC模型大鼠阴道炎症程度、抑制阴道内耐药白色念珠菌生长和菌丝形成；阴道组织扫描电镜结果显示，KBN洗剂能抑制VVC模型大鼠阴道内耐药白色念珠菌粘附和菌丝形成。KBN洗剂对VVC模型大鼠药效优于上市药物洁尔阴洗液。<br>　　2.3KBN洗剂对耐药白色念珠菌致VVC模型小鼠抗炎机制研究<br>　　WB实验结果显示：与正常组比较，模型组小鼠阴道组织TNF-α、IL-1β和IL-6蛋白表达水平显著升高，NLRP3蛋白表达水平显著升高，Dectin-1、Syk、PLCγ2、Card9和NF-κB蛋白表达水平显著升高；与模型组比较，KBN洗剂组上述蛋白表达水平显著降低。<br>　　3KBN洗剂抗耐药白色念珠菌的药效物质及潜在优势探讨<br>　　3.1KBN洗剂抗耐药白色念珠菌的药效物质<br>　　体外抗真菌药敏结果显示，小檗碱（MIC32μg/mL）、巴马汀（MIC128μg/mL）、黄连碱（MIC128μg/mL）、麝香草酚（MIC320μg/mL）、香荆芥酚（MIC320μg/mL）、丁香酚（MIC1280μg/mL）对敏感白色念珠菌98001和耐药白色念珠菌（901、904、311）具有明显抗菌作用。<br>　　3.2KBN洗剂与唑类药物联合抗耐药白色念珠菌的作用研究<br>　　棋盘微量液基稀释法实验结果显示，KBN洗剂/氟康唑对敏感白色念珠菌98001和耐药白色念珠菌901具有协同抗菌作用（FICI分别为:0.28、＜0.09），KBN洗剂/硝酸咪康唑、KBN洗剂/酮康唑对耐药白色念珠菌901具有协同抗菌作用（FICI分别为:0.31、＜0.16）。<br>　　3.3KBN洗剂中单体成分间或单体成分/唑类药物联合抗耐药白色念珠菌的作用研究<br>　　棋盘微量液基稀释法实验结果显示，在KBN洗剂中单体成分间联用中，小檗碱/麝香草酚、小檗碱/丁香酚、巴马汀/丁香酚、麝香草酚/香荆芥酚对敏感白色念珠菌98001具有协同抗菌作用（FICI分别为:0.5、0.5、0.5、0.38），后三组对耐药白色念珠菌901具有协同抗菌作用（FICI分别为:0.5、0.38、0.31）；在KBN洗剂中单体成分与唑类药物联用中，丁香酚/氟康唑、丁香酚/硝酸咪康唑、麝香草酚/硝酸咪康唑、香荆芥酚/硝酸咪康唑对耐药白色念珠菌901有协同抗菌作用（FICI分别为:＜0.27、0.5、0.38、0.25）。<br>　　3.4KBN洗剂逆转耐药白色念珠菌对氟康唑耐药性研究<br>　　在1/2MIC、MIC、2MICKBN洗剂不断刺激诱导下，KBN洗剂能提高耐药白色念珠菌901对氟康唑的敏感性，其MIC从1024μg/mL降低到256μg/mL；耐药白色念珠菌901在F28代内未对KBN洗剂产生耐药。<br>　　结论：<br>　　1KBN洗剂通过多途径发挥抑制耐药白色念珠菌药效<br>　　KBN洗剂能明显抑制耐药白色念珠菌生长，其浓度越高，抗菌效果越好、灭菌时间越短，其效果优于洁尔阴洗液。其抗菌机制可能包括：抑制耐药白色念珠菌生物膜形成、菌丝生长和粘附作用；下调耐药白色念珠菌ERG11基因表达来抑制麦角固醇合成；降低外排泵耐药基因CDR2和MDR1的过表达及外排泵Cdr1p、Cdr2p和Mdr1p外排亢进功能。<br>　　2KBN洗剂改善耐药白色念珠菌致VVC模型小鼠的阴道炎症可能与Dectin-1信号通路相关<br>　　KBN洗剂改善VVC模型小鼠阴道炎症，显示良好抗炎药效。其抗炎机制可能与通过抑制Dectin-1信号通路（Dectin-1/Syk/PLCγ-2/CARD9/NF-κB）减少炎症因子（TNF-α、IL-1β和IL-6）和炎症小体NLRP3分泌相关。<br>　　3KBN洗剂具有多成分协同、提高耐药白色念珠菌敏感性等潜在优势。<br>　　KBN洗剂中抗耐药白色念珠菌的药效物质包括小檗碱、巴马汀、黄连碱、麝香草酚、香荆芥酚、丁香酚；以上部分单体成分间及其与唑类药物对耐药白色念珠菌具有协同抗菌作用；KBN洗剂能提高耐药白色念珠菌对氟康唑的敏感性。<br>　　综上所述，KBN洗剂能通过抗菌和抗炎途径改善耐药白色念珠菌致VVC模型动物阴道炎症症状。