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摘要造血是通过细胞内外的分子和信号通路紧密共同调控的。阐明生态位微环境对人类胚胎造血发育的调控机制一直是体外生成功能性造血干细胞（HSC）的关键所在。针对这一难题，我们建立了基于人胚胎干细胞（hESC）向背主动脉性腺中肾区（AGM）类器官的体外分化系统，该系统概述了胚胎造血的关键阶段，实现在体外模拟胚胎期AGM的发育及HSC的生成。本论文主要研究内容包括以下三个部分：<br>　　1.胚胎发育过程中的第一批HSC是通过内皮细胞向造血转化（EHT）而产生的，这一过程位于AGM区域。为了在体外模拟人类胚胎AGM造血，我们构建了hESC诱导衍生的AGM类器官（iAGM类器官），为研究人类胚胎造血发育的机制提供了一个独特的工具。在形态上，CD45+VE-cadherin+簇状细胞附着在iAGM类器官的囊腔一侧，这类似于天然AGM主动脉内造血簇（IAHCs）；iAGM类器官分化过程中不同阶段对应胚胎造血形成过程中的中胚层-造血内皮-造血变化趋势；在体外具有造血分化潜能并且能够进一步在体外诱导CD3+TCRαβ+T细胞的产生；随后移植到完全免疫缺陷小鼠体内也检测到其具有显著的归巢能力，并能在一定程度上实现T淋巴谱系在内的造血谱系重建；并且进一步的实验表明iAGM类器官中的CD34+细胞是造血重建过程中发挥关键作用的细胞群。总而言之，我们在体外建立了一个模拟AGM空间组织和结构形成的造血分化系统，以重现人类早期胚胎造血，并通过体外和体内实验证实了iAGM类器官的造血潜能。<br>　　2.深入研究人类AGM胚胎造血过程中造血内皮细胞（HEPs）特化以及HSC形成的关键特征及信号调控机制不仅有助于理解HSC产生的分子机制，而且对促进基础向临床转化具有一定的理论指导意义。通过对iAGM类器官进行基因表达谱分析，发现iAGM类器官分化各阶段与体内胚胎造血过程中中胚层发生、造血内皮形成以及造血产生过程是一致的。iAGM类器官上调基因主要与细胞因子分泌、细胞骨架调控和代谢过程等通路相关，其中维甲酸（RA）信号通路在iAGM类器官的生成过程中发挥着重要的作用。通过实验我们也证实在iAGM类器官体外发育的过程中，通过对RA信号通路进行调控，HSC的形成以及功能都受到一定程度的影响，并且由于RA通路抑制剂的使用，导致EHT受到阻断，HSC的数量显著降低。另外RA信号通路激活剂ATRA能有效促进iAGM类器官的造血过程，并伴随着HSC特异性转录因子RUNX1以及HOXA基因簇表达上调，因此RA信号可能是iAGM类器官HOXA基因表达所必需的。RA信号的调控为临床HSC的产生和扩增提供了希望，这也是这些细胞在再生医学和基因治疗中广泛应用的前提。<br>　　3.目前在HSC方面的研究，大多集中在对HSC的发育生成、分化以及体外扩增等方面，然而对于微环境细胞组分及对造血调控上的研究也需要深入探究。为此，我们通过单细胞RNA测序来剖析iAGM类器官中的细胞组分及分子特征，并比较与天然AGM的相似和差异，进一步阐明iAGM造血的信号通路。通过单细胞测序分析出iAGM类器官是由与天然AGM相似的细胞类型组成，包含造血、内皮细胞及相关基质细胞等不同谱系，同时二者也具有转录相似性；从单细胞水平上提供了hESC衍生的iAGM类器官的完整转录图谱，并通过拟时序分析预测了iAGM类器官内皮-造血转化轨迹，在EF1α-EGFP-HOXA9-mCherry双启动子双荧光载体示踪造血样细胞的产生实验中得到验证；另外通过CellChat进一步预测了iAGM类器官微环境基质细胞间的相互作用以及CXCL、IGF、SEMA3和NOTCH等信号通路对造血命运的调控。综上所述，我们的研究在一定程度上能够为在体外模拟和研究人类早期胚胎造血提供一定的指导。