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基于滚环扩增技术构建多功能核酸组装体系及其对宫颈癌细胞的杀伤作用研究

摘要研究背景和目的:<br>  宫颈癌是严重威胁妇女健康的疾病之一。目前,宫颈癌的主要治疗方法包括手术、放疗及化疗,其中,根治性手术不适用于有生育需求的年轻患者,宫颈锥切术可能会增加早产、胎膜早破等不良妊娠结局的发生风险;而放化疗具有副作用大、非靶向性、多药耐药性等局限性。近年来,关于纳米技术在癌症的诊断和治疗领域的研究快速发展。在宫颈癌治疗方面,通过构建纳米载药体系,可有效减少副作用,改善治疗效果。滚环扩增(Rollingcircleamplification,RCA)因其操作简单、放大效率高等优点,现已发展成为纳米生物医学领域的一项重要技术,可用于构建多种功能性DNA纳米结构,实现生物检测、生物成像、药物递送等。本研究旨在基于RCA技术构建具有HeLa细胞靶向性的DNA纳米载药体系(Dox-DNFs),与牛血清白蛋白(Bovineserumalbumin,BSA)修饰的金纳米粒子(Goldnanoparticles,AuNPs)(BSA-AuNPs)相结合,分别通过主动靶向和被动靶向进入HeLa细胞,并在溶酶体酸性条件下发生聚集,基于质子海绵效应导致溶酶体溶胀,从而实现靶向化疗/光热联合治疗,通过体内、体外实验研究该体系对宫颈癌细胞的杀伤作用。<br>  方法:<br>  (1)本研究基于RCA技术构建DNA纳米花型结构(DNAnanoflowers,DNFs),用于负载并靶向递送抗肿瘤药物阿霉素(Doxorubicin,Dox)。通过将HeLa细胞核酸适体的互补序列和载药位点设计到环状模板中,基于RCA反应制备长单链DNA(Single-strandedDNA,ssDNA),进而自组装得到对HeLa细胞具有靶向识别能力的DNFs,并将所制备的DNFs作为药物载体用于负载Dox。对DNFs和载药DNFs(Dox-DNFs)的尺寸、形貌、表面电荷等进行表征,并探究药物负载和释放能力。<br>  (2)采用柠檬酸钠还原法合成AuNPs,通过BSA修饰,制备电荷可反转的金纳米粒子(BSA-Au),对其粒径、形貌及不同pH下的表面电荷等进行表征。研究不同pH下BSA-Au和DNFs的相互作用,并对体外光热效应进行初步研究。<br>  (3)将基于RCA构建的Dox-DNFs与BSA-Au相结合,采用共聚焦显微镜、细胞透射电镜等对Dox-DNFs@BSA-Au的主动、被动靶向识别能力进行表征。利用CCK-8实验、流式细胞术、活/死细胞染色实验等探究Dox-DNFs@BSA-Au对HeLa细胞的毒性作用。在小鼠体内建立HeLa细胞异体移植肿瘤模型,研究所构建的多功能核酸组装体在活体中的化疗/光热联合治疗效果。<br>  结果:<br>  (1)基于RCA反应制备得到具有褶皱、多孔结构的DNFs,粒径约为200nm。该材料实现了抗肿瘤药物Dox的有效负载,负载效率高达71.67%。且Dox-DNFs具有良好的稳定性,可在生理条件下稳定封装Dox,并在酸性pH下实现Dox的可控释放,16h内释放量可达78.69%。<br>  (2)制备得到BSA-Au球形纳米粒子,粒径约为25nm,且具有良好的单分散性。实验测得所用BSA的等电点约为5.5。Zeta电位结果表明,当pH<5.5时,BSA-Au带正电;当pH>5.5时,BSA-Au带负电,因此BSA-Au具有电荷可反转的性质。当pH<5.5时,带正电荷的BSA-Au可通过静电作用聚集在DNFs上。紫外-可见吸收光谱和Zeta电位结果表明,此时BSA-Au可在DNFs上发生聚集。体外光热实验结果表明,BSA-Au与DNFs相互作用后温度升高至46.1℃,且光热性能稳定。<br>  (3)共聚焦显微镜成像结果表明,Dox-DNFs对HeLa细胞具有主动靶向识别能力,细胞透射电镜图显示BSA-Au可通过EPR(Enhancedpenetrationandretention)效应被动靶向进入HeLa细胞。细胞实验表明,所构建的Dox-DNFs@BSA-Au纳米组装体系可有效诱导HeLa细胞凋亡,CCK-8实验显示该体系处理后HeLa细胞的活性为43.26%,流式细胞实验表明该体系的细胞凋亡率为40.03%。进一步,将Dox-DNFs@BSA-Au用于小鼠异体移植宫颈癌模型的治疗,对小鼠体内肿瘤表现出明显的抑制作用,且治疗效果比单一化疗或光热治疗效果显著。此外,治疗过程中小鼠各主要脏器组织切片并未观察到明显损伤,表明Dox-DNFs@BSA-Au具有良好的生物安全性。<br>  结论:<br>  (1)基于等温扩增RCA技术DNA自组装得到含有HeLa细胞核酸适体的DNA纳米花型结构(DNFs),用于高效负载化疗药物Dox。<br>  (2)制备了具有电荷可反转性质的BSA-Au,可通过静电吸附在DNFs上,在808nm激光照射下发挥光热效应。<br>  (3)将用于药物靶向递送的Dox-DNFs与用于光热消融的BSA-Au相结合,构建多功能核酸组装体系(Dox-DNFs@BSA-Au),实现了对HeLa细胞的联合杀伤作用,显著抑制小鼠体内移植瘤的生长。

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