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摘要目的：<br>　　越来越多的证据表明，大气颗粒物（ParticulateMatters，PM）暴露可诱导心毒性，但相关致病机制尚不明确。本研究通过构建真实环境颗粒物暴露模型、心肌细胞血小板衍生生长因子受体β（PlateletDerivedGrowthFactorReceptorβ，PDGFRβ）高表达模型、小鼠心脏组织PDGFRβ高表达模型、心肌细胞甲基化抑制模型深入探讨大气PM暴露诱导PDGFRβ基因高甲基化致心毒性的潜在机制，为寻找大气PM暴露致心毒性潜在生物标志物提供重要的实验依据和新的研究方向。<br>　　方法：<br>　　1.基于RRBS的大气PM暴露致小鼠心脏组织DNA甲基化差异基因的筛选。<br>　　2018年11月至2019年1月在河北省石家庄市，通过真实环境颗粒物暴露模型，对雄性C57BL/6小鼠进行为期6周的PM染毒。实验随机分为对照组和PM暴露组。利用简化甲基化测序（ReducedRepresentationBisulfiteSequencing，RRBS）观察小鼠心毒性相关的DNA甲基化模式的变化；利用高通量的重亚硫酸盐测序法（NextGenerationSequencing-BisulfiteSequencingPCR，NGS-BSP）验证PDGFRβ启动子甲基化水平；利用HE染色观察小鼠心脏组织病理改变；利用实时荧光定量PCR（RealTimeFluorescenceQuantitativePCR，RT-qPCR）检测PDGFRβ基因mRNA的表达水平；利用蛋白免疫印迹（WesternBlot，WB）实验检测PDGFRβ及其下游MEK/ERK通路相关蛋白的表达水平。<br>　　2.大气PM诱导PDGFRβ基因高甲基化致心肌肥厚的作用机制研究。<br>　　1）构建心肌细胞PDGFRβ高表达模型：在原代心肌细胞及AC16心肌细胞构建PDGFRβ高表达模型，实验分为4组：对照组、大气PM暴露组、PDGFRβ高表达组（hPDGFRβ）、PDGFRβ高表达后大气PM暴露组（hPDGFRβ+PM）。<br>　　2）构建小鼠心脏组织PDGFRβ高表达模型：通过尾静脉注射腺相关病毒9（AdenoAssociatedVirus9，AAV9）20天后，构建心脏组织PDGFRβ高表达模型；实验分为6组：空白对照组、大气PM暴露组、PDGFRβ高表达组（hPDGFRβ）、空病毒组（PDGFRβ-con）、空病毒注射后大气PM暴露组（PDGFRβ-con+PM）、PDGFRβ高表达后大气PM暴露组（hPDGFRβ+PM）。<br>　　3）构建心肌细胞甲基化抑制模型：利用甲基化抑制剂5-氮杂胞苷（5-Azacytidine，5AZA）处理原代心肌细胞及AC16心肌细胞构建甲基化抑制模型，实验分为4组：对照组、大气PM暴露组、甲基化抑制剂组（5AZA）、甲基化抑制后大气PM暴露组（5AZA+PM）。<br>　　4）利用CCK8实验检测心肌细胞的活力及绿色荧光检测心肌细胞病理改变；利用RT-qPCR及WB检测PDGFRβ及其下游MEK/ERK通路上相关基因mRNA及其蛋白的表达。利用RT-qPCR检测DNA甲基转移酶1（DNAMethyltransferase1，DNMT1）、DNA甲基转移酶3A（DNAMethyltransferase3A，DNMT3A）、DNA甲基转移酶3B（DNAMethyltransferase3B，DNMT3B）；心肌肥厚标志物相关基因心房利钠因子（AtrialNatriureticFactors，ANF）、脑利钠因子（BrainNatriureticFactor，BNF）、β肌球蛋白重链（β-MyosinHeavyChain，β-MHC）mRNA的表达。利用超声心动图检测小鼠的心功能。<br>　　3.大气PM暴露诱导DNA甲基化水平改变致心肌脂代谢紊乱的影响。<br>　　通过上述构建的真实环境颗粒物暴露模型、心肌细胞PDGFRβ高表达模型、小鼠心脏组织PDGFRβ高表达模型，观察小鼠心脏及心肌细胞脂滴累积变化；脂质组学检测PM暴露与非暴露组小鼠心脏组织脂质代谢的变化；利用WB检测PDGFRβ下游MEK/ERK通路相关蛋白及过氧化物酶体增殖物激活受体α（PeroxisomalProliferatorActivatedReceptorα，PPARα）和过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PeroxisomalProliferatorActivatedReceptorγ，PPARγ）的表达。<br>　　结果：<br>　　1.基于RRBS的大气PM暴露致小鼠心脏组织DNA甲基化差异基因的筛选。<br>　　1）RRBS结果：共检测到差异甲基化基因6604个，其中高甲基化基因占57.66%，低甲基化基因占42.34%。差异甲基化基因共富集在271条通路上，其中差异显著性较大且与心毒性密切相关的信号通路为MAPK中的MEK/ERK通路。MEK/ERK通路上发现一个重要的与心毒性相关的差异甲基化基因PDGFRβ。<br>　　2）NGS-BSP结果：与对照组相比，大气PM暴露组PDGFRβ基因的甲基化水平升高，与RRBS结果一致。<br>　　3）HE染色结果：与对照组相比，大气PM暴露组小鼠右心室游离壁增厚。<br>　　4）RT-qPCR与WB结果：与对照组相比，大气PM暴露组中PDGFRβ表达水平显著下降，且PDGFRβ下游MEK/ERK通路中RAS、丝裂原活化蛋白质激酶激酶激酶（RheumatoidArthritisFactor，RAF）、丝裂原活化蛋白质激酶激酶（MAPKERKKinase，MEK）、丝裂原活化蛋白质激酶（ExtracellularRegulatedProteinKinases，ERK）表达水平也呈下降趋势。<br>　　2.大气PM诱导PDGFRβ基因高甲基化致心肌肥厚的作用机制研究。<br>　　1)心肌细胞CCK8结果：心肌细胞中大气PM暴露浓度为25μg/mL，5AZA暴露浓度为10μΜ。<br>　　2)小鼠心脏组织HE染色结果：与对照组相比，大气PM暴露组小鼠右心室游离壁增厚，hPDGFRβ组中右心室游离壁变薄。<br>　　3)小鼠超声心动图结果：与对照组相比，大气PM暴露组小鼠心室间隔（InterventricularSeptum，IVS）、收缩期室间隔厚度（InterventricularseptalThicknessatSystolic，IVSs）、舒张期室间隔厚度（InterventricularSeptalThicknessatDiastole，IVSd）、左室后壁（LeftVentricularPosteriorWall，LVPW）、收缩期左室后壁厚度（LeftVentricularPosteriorWallofSystolic，LVPWs）、舒张期左室后壁厚度（LeftVentricularPosteriorWallofDiastolic，LVPWd）有增加趋势，hPDGFRβ组与暴露组相比各项指标均呈下降趋势。<br>　　4)RT-qPCR与WB结果：与对照组相比，大气PM暴露组中PDGFRβ及其下游MEK/ERK通路中相关基因mRNA及蛋白表达水平明显下降，ANF、BNF、β-MHCmRNA表达呈上升趋势；hPDGFRβ组与大气PM暴露组相比，MEK/ERK通路中相关基因mRNA及蛋白表达水平显著上升，ANF、BNF、β-MHCmRNA表达水平明显下降。<br>　　3.大气PM暴露诱导DNA甲基化水平改变致心肌脂代谢紊乱的影响。<br>　　1)小鼠心脏组织及心肌细胞组织病理结果：与对照组相比，暴露组心脏组织中有少量脂滴累积；暴露组心肌细胞中心肌肥大、核质比减小、面积比增大、脂滴累积明显。<br>　　2)WB结果：与对照组相比，大气PM暴露组中PPARα显著上升；与暴露组相比，hPDGFRβ组中，PPARα蛋白表达明显下降。<br>　　3)脂质组学结果：对照组与暴露组之间脂质化合物差异显著。正离子模式下磷脂酰胆碱（Phosphatidylcholine，PC）子类别最多，达348个，甘油三酯有（Triacylglycerols，TAG）219个子类别。负离子模式下PC亚型最多，有101种，磷脂酰乙醇胺（Phosphatidylethanolamine，PE）次之，有90种。<br>　　结论：<br>　　1.大气PM真实暴露使小鼠心脏组织DNA甲基化模式改变。<br>　　2.大气PM暴露致PDGFRβ基因甲基化水平升高，可能通过影响其下游MEK/ERK通路导致心肌肥厚；PDGFRβ基因高表达可能改善由大气PM暴露引起的心肌肥厚，促进心功能恢复。<br>　　3.大气PM暴露导致小鼠心肌脂代谢紊乱，这可能与PDGFRβ高甲基化有关。