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脐带间充质干细胞治疗小鼠卵巢早衰作用机理研究

摘要卵巢早衰(Prematureovarianfailure,POF)指女性在40岁之前,卵巢中卵泡储备耗竭,卵巢功能衰退的一种疾病。近年来,POF的发病年龄逐年降低,发病率持续上升,目前尚无有效的治疗手段。4-乙烯基-1-环己烯二环氧化物(4-vinylcyclohexenediepoxide,VCD)是工业生产中产生的一种环境污染物。研究显示,VCD可诱导卵巢中原始卵泡和初级卵泡数量显著下降,从而造成卵巢早衰。因此,VCD常被用于诱导卵巢早衰动物模型的建立,但是VCD靶向卵巢中的原始和初级卵泡造成其数量下降的机理尚不明确。<br>  脐带间充质干细胞(Umbilicalcordmesenchymalstemcells,UCMSCs)是来源于新生儿脐带组织中的一种干细胞,研究发现UCMSCs对卵巢早衰有一定的治疗作用,但其具体治疗机制尚不清楚。胰岛素样生长因子受体1(Insulin-likegrowthfactor1receptor,IGF1R)是一种受体酪氨酸激酶,IGF1R/Akt/mTOR信号通路与哺乳动物的原始卵泡和初级卵泡发育密切相关。但IGF1R是否是VCD影响卵巢中原始卵泡和初级卵泡发育的靶点,以及UCMSCs对卵巢早衰的治疗作用是否与IGF1R相关尚有待进一步研究。<br>  本研究通过腹腔注射VCD诱导建立POF小鼠模型,并利用UCMSCs治疗POF小鼠,通过检测卵巢内IGF1R的表达变化,颗粒细胞增殖和抗凋亡,激素分泌等颗粒细胞功能,以及IGF1R/Akt/mTOR通路激活情况,研究UCMSCs治疗POF的分子机制,为临床应用UCMSCs治疗POF提供理论依据。<br>  主要研究结果如下:<br>  (1)连续15天腹腔注射VCD,可以诱导小鼠出现发情周期紊乱,卵巢内卵泡数量显著下降及外周血雌激素显著下降等卵巢早衰症状,对小鼠体重等无显著影响;在15天建模期间小鼠卵巢中的原始卵泡,初级卵泡和有腔卵泡数量显著减少,卵巢中IGF1R的表达量随注射天数而降低。结果表明,连续15天腹腔注射VCD可以成功构建小鼠卵巢早衰模型。<br>  (2)500μMVCD处理人卵巢颗粒细胞(KGN)细胞24h后,显著增加KGN细胞凋亡比例,引起的细胞周期分布紊乱同时促进了KGN细胞的自噬;WesternBlotting结果表明VCD下调KGN细胞中IGF1R的表达水平,抑制mTOR和Akt磷酸化水平,进而发挥对KGN细胞的毒性作用。<br>  (3)利用脐带组织块法培养法分离UCMSCs,UCMSCs呈成纤维样,梭形,生长增殖正常;所分离的UCMSCs表达间充质干细胞的阳性标记物CD105和CD90,而不表达CD34、CD45以及HLA-DR;此外,所分离的UCMSCs具有成脂、成骨及成软骨三系分化能力。采用超速离心法提取UCMSCs来源外泌体(UCMSCs-EXOs),透射电镜下UCMSCs-EXOs呈现典型的杯状或盘状囊泡,直径在100-120nm,纳米粒子跟踪分析显示检测悬液中原始颗粒浓度为1.24×109个/mL,WesternBlotting结果进一步确认UCMSCs-EXOs表达CD9、CD63以及TSG101表面标志蛋白,符合UCMSCs-EXOs鉴定标准;此外,外泌体测序结果显示外泌体含有丰富的miRNA。<br>  (4)卵巢早衰小鼠尾静脉注射UCMSCs后,与未治疗组小鼠相比,UCMSCs组小鼠发情周期恢复正常,卵巢中各级卵泡数量显著上升,卵巢中凋亡细胞数量减少,外周血雌激素水平显著上升,同时,卵巢中IGF1R表达水平上升;结果表明UCMSCs可以改善由VCD造成的卵巢功能损害,减少颗粒细胞凋亡,恢复IGF1R表达水平,挽救卵巢储备。<br>  (5)UCMSCs-EXOs体外培养卵巢结果表明,UCMSCs-EXO增强卵泡对VCD的抵抗力,促进了原始卵泡的生长;UCMSCs-EXOs与VCD共处理KGN细胞24h后,显著恢复了VCD导致的细胞活力下降,改善了VCD引起的细胞周期分布紊乱,同时减少了VCD造成的细胞凋亡;WesternBlotting结果表明UCMSCs-EXOs上调KGN细胞中IGF1R的表达水平,促进Akt及mTOR磷酸化水平,进而实现对KGN细胞的保护作用。

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