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摘要微小隐孢子虫（Cryptosporidiumparvum）是一种重要的人兽共患肠道寄生虫，可导致婴幼儿、新生动物和免疫缺陷个体的严重腹泻，甚至死亡。它是造成全球2岁以内儿童致死性腹泻的第二大病因，也是引起1月龄内犊牛腹泻的主要原因。目前被批准的可用于治疗隐孢子虫病的药物仅有硝唑尼特，但该药物在健康个体中仅有56%～96%的疗效，在免疫功能缺陷或婴幼儿个体中没有疗效，目前尚没有用于预防隐孢子虫感染的疫苗。环状RNA（circularRNA，circRNA）可在不同水平上调控基因的表达，参与各种生理和病理过程。研究显示，包括隐孢子虫在内的多种寄生虫感染可导致宿主circRNAs的显著差异表达，但关于这些显著差异表达circRNAs（differentiallyexpressedcircRNAs，DEcircRNAs）的功能仍然未知。基于此，本研究利用微阵列芯片（microarray）技术检测了C.parvum感染24h的HCT-8细胞中的circRNAs表达谱，筛选出DEcircRNAs，应用实时荧光定量PCR（quantitativereal-timepolymerasechainreaction，qRT-PCR）、过表达和干扰技术、免疫印迹（westernblot）、双荧光素酶报告基因等试验方法，探究了circRNA在C.parvum感染HCT-8细胞中的调节作用及潜在的调控机制，获得了以下研究结果：<br>　　1.获得了C.parvum感染的HCT-8细胞中的circRNAs表达谱：对C.parvum感染HCT-8细胞24h的样品进行microarray分析发现，共有178个DEcircRNAs[foldchange(FC)＞2、P＜0.05]，包括128个上调和50个下调的circRNAs；对DEcircRNAs的来源基因进行GO富集分析，发现它们富集于重要的生物学过程和分子功能；对DEcircRNAs的来源基因进行KEGG通路分析，发现它们富集于重要的信号通路，特别是代谢通路。<br>　　2.发现上调表达的circRNAciRS-7显著促进C.parvum在HCT-8细胞中的增殖：circRNAciRS-7（hsa_circ_0001946_CBC1，又称为CDR1as）在microarray结果中显著上调（FC=7.96530932、P＜0.05）；qRT-PCR分析发现，HCT-8细胞中ciRS-7的表达水平在感染后12h（12hpostinfection，12hpi）～48hpi显著升高；过表达ciRS-7显著促进感染细胞中C.parvumhsp70基因的mRNA表达水平；而干扰ciRS-7表达的作用相反。<br>　　3.获得了circRNAciRS-7的潜在靶miRNAs：利用starBasev3.0预测到ciRS-7共有22个潜在的靶miRNAs；qRT-PCR分析发现，HCT-8细胞中miR-1270、miR-219a-5p、miR-135b-5p、miR-135a-5p、miR-139-3p、miR-601和miR-7的表达水平在24hpi显著降低；过表达ciRS-7显著降低感染细胞中miR-1270、miR-219a-5p、miR-135b-5p、miR-135a-5p和miR-139-3p的表达水平，而干扰ciRS-7的表达显著升高感染细胞中miR-1270、miR-219a-5p、miR-135b-5p、miR-135a-5p和miR-7的表达水平；双荧光素酶报告基因试验发现，在HCT-8细胞中ciRS-7和miR-1270、miR-219a-5p以及miR-135a-5p存在结合作用。由此可见，在HCT-8细胞中，ciRS-7可靶向结合miR-1270、miR-219a-5p以及miR-135a-5p。<br>　　4.发现circRNAciRS-7靶向miR-1270调控NF-κB信号通路影响C.parvum在HCT-8细胞中的增殖：预测并证实了miR-1270和核转录因子-κB（nucleartranscriptionfactor-κB，NF-κB）信号通路的亚基relA（p65）基因的3''非翻译区（3''-untranslatedregion，3''-UTR）在HCT-8细胞中存在结合作用；HCT-8细胞中relA基因的mRNA表达水平在12hpi～48hpi显著升高，且RELA蛋白质的表达水平在24hpi显著升高，NF-κB信号通路下游因子nos2和cxlc2基因的mRNA表达水平在24hpi也显著升高；转染miR-1270mimics显著抑制感染细胞中relA基因的mRNA和蛋白质表达水平以及nos2和cxlc2基因的mRNA表达水平，而miR-1270inhibitor的作用相反；过表达ciRS-7显著促进感染细胞中relA基因的mRNA和蛋白质表达水平以及nos2和cxlc2基因的mRNA表达水平，而干扰ciRS-7表达的作用相反；miR-1270mimics逆转了过表达ciRS-7对感染细胞中的relA以及nos2和cxlc2基因的mRNA表达水平的上调作用。进一步研究发现，miR-1270mimics显著抑制感染细胞中C.parvumhsp70基因的mRNA表达水平，而miR-1270inhibitor的作用相反；miR-1270mimics逆转了过表达ciRS-7对感染细胞中C.parvumhsp70基因的mRNA表达水平的上调作用。<br>　　5.发现circRNAciRS-7靶向miR-135a-5p调控STAT1和p-STAT1的表达影响C.parvum在HCT-8细胞中的增殖：预测并证实了miR-135a-5p和信号传导及转录激活因子1（signaltransducerandactivatoroftranscription1，stat1）基因的3''-UTR区在HCT-8细胞中存在结合作用；HCT-8细胞中stat1基因的mRNA表达水平在12hpi～72hpi显著上调，且STAT1和磷酸化STAT1（p-STAT1）的蛋白质表达水平在24hpi显著上调；转染miR-135a-5pmimics显著抑制感染细胞中STAT1和p-STAT1的蛋白质表达水平，而miR-135a-5pinhibitor的作用相反；过表达ciRS-7显著促进感染细胞中STAT1和p-STAT1的蛋白质表达水平，而干扰ciRS-7表达的作用相反；miR-135a-5pmimics逆转了过表达ciRS-7对感染细胞中STAT1和p-STAT1蛋白质表达水平的上调作用。进一步研究发现，虽然miR-135a-5pmimics不影响感染细胞中C.parvumhsp70基因的mRNA表达水平，但miR-135a-5pinhibitor显著上调了感染细胞中C.parvumhsp70基因的mRNA表达水平；miR-135a-5pinhibitor逆转了干扰ciRS-7的表达时对感染细胞中C.parvumhsp70基因的mRNA表达水平的下调作用。<br>　　6.发现circRNAciRS-7靶向miR-219a-5p调控细胞自噬影响C.parvum在HCT-8细胞中的增殖：HCT-8细胞中自噬关键蛋白LC3B-Ⅱ和p62的蛋白质表达水平在8hpi～48hpi显著增加，表明C.parvum感染诱发了HCT-8细胞的不完全自噬；转染miR-219a-5pmimics显著增加了感染细胞中LC3B-II的蛋白质表达水平但降低了p62的蛋白质表达水平，而miR-219a-5pinhibitor的作用相反；过表达ciRS-7显著降低了感染细胞中LC3B-Ⅱ的蛋白质表达水平但升高了p62的蛋白质表达水平，而干扰ciRS-7表达的作用相反；miR-219a-5pmimics逆转了过表达ciRS-7对感染细胞中LC3B-Ⅱ蛋白质表达的抑制和p62蛋白质表达的促进作用；预测发现miR-219a-5p有16个与自噬通路相关的潜在靶基因，其中akt1、pik3ca和p62基因的mRNA表达水平在感染细胞中显著升高，但miR-219a-5p与akt1、pik3ca和p62基因在HCT-8细胞中均不存在结合作用，提示ciRS-7/miR-219a-5p轴可能通过其他机制调节C.parvum感染HCT-8细胞的自噬。进一步研究发现，miR-219a-5pmimics显著抑制了感染细胞中C.parvumhsp70基因的mRNA表达水平，而miR-219a-5pinhibitor的作用相反；miR-219a-5pmimics逆转了过表达ciRS-7对感染细胞中C.parvumhsp70基因的mRNA表达水平的上调作用。<br>　　综上所述，C.parvum感染导致HCT-8细胞的circRNAs表达谱的显著改变，显著上调表达的circRNAciRS-7可通过靶向miR-1270、miR-135a-5p和miR-219a-5p分别调控NF-κB信号通路、STAT1和p-STAT1的表达和细胞自噬来促进C.parvum在HCT-8细胞中的增殖。研究初步揭示了宿主circRNAciRS-7在隐孢子虫感染中的作用，为进一步厘清隐孢子虫感染和致病机制提供了新思路。