摘要卵母细胞成熟质量和受精后胚胎发育能力是支持雌性动物繁殖能力的关键因素。与对称的有丝分裂不同,卵母细胞成熟过程中为最大程度保留母源物质储备,在实现染色体减半的同时进行胞质极度不对称的减数分裂。因为卵母细胞完成生长,启动减数分裂后处于转录沉默状态,减数分裂过程和受精后早期胚胎发育所需的物质依赖于在卵泡生长阶段持续积累的母源因子(mRNA,蛋白和代谢物质等)。研究表明,异源二聚体G蛋白能够以受体不依赖的方式被不对称激活参与多种细胞不对称分裂过程。G蛋白偶联雌激素受体(G-proteincoupledestrogen-membranereceptor,GPER)在小鼠卵母细胞有表达,且在卵母细胞成熟过程中GPER呈现不对称分布现象,在靠近纺锤体的皮质区一侧有更高的表达。本研究主要探索GPER在卵母细胞成熟过程中对纺锤体迁移、定位、不对称分裂和母源mRNA翻译调控的分子机制。<br> 卵母细胞减数分裂过程中母源mRNA翻译受阻、纺锤体组装异常和染色体分离错误往往导致胚胎发育异常,流产或严重的遗传疾病,例如唐氏综合症等,对人类健康造成严重危害。同时,卵母细胞减数分裂异常和质量下降直接影响家畜繁殖力,给畜牧生产造成严重损失。生发泡破裂(Germinalvesiclebreakdown,GVBD)后,母源mRNA翻译、减数分裂纺锤体的组装、纺锤体-染色体相互作用的建立和卵母细胞极性形成是完成不对称分裂的关键过程,揭示参与这些重要过程的分子靶标及其对卵母细胞减数分裂的调控机制是生殖生物学胚胎工程技术研究的主要目标。研究工作对揭示雌性动物生殖机理、提高家畜繁殖能力和治疗雌性动物不孕具有重要参考价值。<br> 主要研究内容和和已取得的研究成果如下:<br> (1)GPER参与卵母细胞不对等分裂<br> 雌激素膜受体GPER在卵母细胞减数分裂调控中具有重要作用。卵母细胞不对称分裂和第一极体排出主要依赖于皮质纺锤体定位,皮质重塑,卵母细胞极化及后续肌动蛋白依赖性的纺锤体向皮质迁移。本研究主要探讨GPER在卵母细胞不对等分裂中的作用机制。分离小鼠卵母细胞,蛋白质免疫印迹和免疫荧光染色技术检测GPER在卵母细胞不同阶段的表达与定位,结果显示GPER在卵母细胞减数分裂的各阶段均有表达,且在生发泡(GV)时期,GPER定位于胞质,并在卵母细胞膜上富集;当生发泡破裂(GVBD)后,GPER主要分布于染色体周围;从第一次减数分裂中期(MI)开始,随着微管在染色体周围形成双极纺锤体,GPER则主要集中在梭形纺锤体区。从后期开始,GPER主要定位于纺锤体两极靠近染色体一侧。运用小干扰RNA(siRNA)显微注射技术敲低卵母细胞内源GPER表达,发现GPER敲低后不会影响卵母细胞GVBD的发生,但会导致极体排出率下降,MI纺锤体不能向皮质区迁移,排出体积较大的极体。此外,敲低GPER后胞质微丝的组装水平和微丝帽形成率显著降低,纺锤体异常组装染色体分离错误显著升高。蛋白质免疫印迹结果表明,敲低小鼠卵母细胞内源GPER蛋白表达导致MI期卵母细胞PI3K-AKT信号通路活性下降,Rho家族小分子GTP酶成员RAC1,RHOA,CDC42蛋白表达水平降低,抑制微丝解聚蛋白Cofilin磷酸化。通过对GPER敲低卵母细胞注射外源性GpermRNA,能挽救GPER蛋白在卵母细胞表达,发现外源GPER的表达可以挽救由GPER敲低引起的极体排出失败和极体大小的异常,恢复微丝帽组装。<br> (2)GPER参与卵母细胞减数分裂过程中母源mRNA翻译调控<br> 完成生长的卵母细胞是转录沉默的,驱动减数分裂所需的大量蛋白来自于卵母细胞生长阶段储备的母源mRNA的持续翻译。这些母源mRNA的翻译过程主要依赖于胞质聚腺苷酸化和翻译激活调控,但是,参与调控胞质聚腺苷酸化和母源mRNA的上游调控通路及其在卵母细胞减数分裂过程中的时空特异性调控规律不是很清楚。本研究旨在探索GPER在调控小鼠卵母细胞减数分裂过程中对母源mRNA翻译的调控机制。通过Cre/Loxp系统构建卵母细胞Gper特异性敲除小鼠(Gper-CKO),发现Gper-CKO卵母细胞成熟质量下降、纺锤体组装和极体排出异常,囊胚发育率低,胚胎发育出现2-细胞阻滞;HPG蛋白质翻译检测发现,GPER缺失卵母细胞减数分裂过程整体翻译活性显著下降;PAT多聚腺苷酸尾长分析表明,GPER缺失卵母细胞参与减数分裂调控的关键基因(Mos,Tpx2,Dazl,Ccnb1,Btg4,Cnot7等)mRNA多聚腺苷酸化受阻。卵母细胞转录组测序结果表明,GPER缺失卵母细胞中有161个基因显著上调,1212个基因显著下调。KEGG分析显示,Gper-CKO卵母细胞下调基因主要富集在EGFR信号通路、MAPK信号通路、肌动蛋白细胞骨架和细胞内吞相关通路基因。基因本体论(GeneOntology,GO)分析显示,与RNA结合、mRNA3’UTR结合和翻译起始因子活性相关的基因在Gper-CKO卵母细胞中显著下调。此外Gper-CKO卵母细胞中与PKB结合、肌动蛋白结合相关基因也显著下调。这些信号通路或生物过程都与mRNA翻译调控和肌动蛋白骨架组装相关。进一步通过蛋白质免疫印迹试验分析了卵母细胞中ERK1/2和PI3K-AKT信号通路活性,结果表明GPER缺失卵母细胞ERK1/2和PI3K-AKT信号通路关键蛋白磷酸化水平显著下调。这些研究结果证明,GPER通过ERK1/2和PI3K-AKT信号通路活性来调控卵母细胞母源mRNA多聚腺苷酸化和翻译激活。<br> (3)GPER参与介导EGF对卵母细胞减数分裂过程中母源mRNA翻译调控<br> 卵母细胞成熟和受精后发育能力很大程度上依赖于发育过程中与包围它的卵丘/颗粒细胞之间复杂的相互作用。除了为卵母细胞提供关键的代谢物支持外,卵丘细胞还参与卵母细胞减数分裂的恢复、细胞骨架组装和母源mRNA翻译调控。EGF可通过激活卵丘细胞EGFR,在卵母细胞减数分裂过程中以PI3K-AKT信号通路依赖的方式调控母源mRNA翻译。但目前尚不清楚,只在卵丘细胞上表达的EGFR被激活后如何将信号跨细胞传递给卵母细胞,因此本研究旨在探讨GPER参与介导EGF对卵母细胞母源mRNA翻译调控的机制。HPG蛋白质翻译检测发现,EGF处理卵丘-卵母细胞复合体(Cumulus-oocytecomplexes,COCs)后能显著增加卵母细胞整体翻译水平,但对脱去卵丘的卵母细胞(Denudedoocytes,DO)无影响,说明EGF以卵丘细胞依赖的方式促进母源mRNA翻译;蛋白质免疫印迹结果表明EGF以卵丘细胞依赖的方式增加卵母细胞GPER蛋白水平,并促进GPER在卵母细胞皮质区富集;免疫荧光染色和免疫电镜分析表明,GPER阳性信号存在于卵母细胞透明带,且EGF处理COCs来源的卵母细胞中GPER阳性信号高于对照组。进一步研究表明,GPER与囊泡标记蛋白共定位,EGF促进卵丘细胞GPER阳性囊泡形成,并向卵母细胞传递。EGF通过促进循环囊泡运输蛋白RAB11A表达来抑制GPER在溶酶体定位,促进GPER在细胞膜上的定位。这些研究结果表明,EGF通过促进卵丘细胞GPER阳性囊泡向卵母细胞传递来调控卵母细胞母源mRNA翻译。<br> 综上所述,在小鼠卵母细胞减数分裂各阶段都有GPER表达,GPER通过ERK1/2和PI3K-AKT信号通路参与调控卵母细胞母源mRNA多聚腺苷酸化和翻译激活,在Rho小分子GTP酶介导的微丝动态组装、纺锤体向皮质区迁移、卵母细胞成熟和胚胎发育中扮演重要作用。
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