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摘要本研究旨在揭示CPB术后发生下消化道出血患者肠道微生物紊乱与下消化道出血的因果关系及其机制。主要研究内容和结果如下：<br>　　研究一 心血管体外循环手术后下消化道出血患者的粪菌对小鼠肠道的影响<br>　　为研究心血管体外循环手术后下消化道出血患者的粪菌对小鼠肠道的影响，选择6-8周龄雄性C57BL/6小鼠48只，随机分成4组，每组12只。用下消化道出血患者术前粪便（Pre-GIB）、下消化道出血患者术后粪便（Post-GIB）、非消化道出血患者术前粪便（Pre-NGIB）以及非消化道出血患者术后粪便（Post-NGIB）制备菌液。同时进行抗生素饮水与灌胃处理构建限菌鼠模型后，实验第1、2、3d与第7d分别灌服上述四组菌液。实验第35d屠宰小鼠取样，检测肠道微生物组等指标；各指标均采用two-wayANOVO分析，结果如下：<br>　　1.肠道微生物组：Post-NGIB组与Post-GIB组小鼠（下称Post组）的微生物Chao1指数和Obersevd_species显著低于Pre-NGIB组与Pre-GIB组（下称Pre组）（P＜0.05）；Pre-GIB组与Post-GIB组小鼠（下称GIB组）的微生物Shannon与Pielou_e指数显著低于Pre-NGIB组与Post-NGIB组（下称NGIB组）（P＜0.05）。且各组小鼠肠道微生物之间β多样性差异显著（P＜0.05）。差异分析发现，在门水平上，Pre-GIB组富集Verrucomicrobia门；Post-GIB组富集Firmicutes与Proteobacteria门。在属水平上，Pre-GIB组的特异菌属为Akkermansia、Allobacuium、Exiguobacterium、Brevundimonas；Post-GIB组的特异菌属为Bacteroides、Shigella、Helicobacter、Owenweeksia、Robinsoniella、Anaerotruncus；Pre-NGIB组的特异菌属为Blautia、Sphingobium,、Roseivirga；Post-NGIB组的特异菌属为Parabacteroides、Anaerostipes。这些结果表明，CPB手术后，特别是CPB术后发生下消化道出血患者的粪菌导致小鼠肠道微生物多样性降低，微生物组成紊乱，有害菌增加而有益菌减少。<br>　　2.粪便短链脂肪酸：Post组小鼠粪便丙酸水平显著低于Pre组（P＜0.05）；GIB组小鼠粪便乙酸、丙酸、丁酸以及总短链脂肪酸水平显著低于NGIB组（P＜0.05）。这些结果表明，CPB手术后，特别是CPB术后发生下消化道出血的患者，其肠道微生物产生短链脂肪酸的能力显著降低。<br>　　3.肠道细胞因子表达：Post组小鼠盲肠Il-17基因表达显著高于Pre组（P＜0.05）；GIB组小鼠盲肠Il-1b、Il-17基因表达显著高于NGIB组（P＜0.05）。上述结果表明，CPB术后患者的粪菌以及下消化道出血患者的粪菌导致小鼠盲肠更加严重的炎症反应。<br>　　4.肠道紧密连接蛋白表达：相比于Pre组，Post组小鼠空肠Occludin、ZO-2、Claudin-4以及结肠ZO-2基因表达显著降低（P＜0.05）；GIB组盲肠ZO-1基因表达显著低于NGIB组（P＜0.05）。此外，Post-GIB组小鼠盲肠Occludin基因表达显著低于Post-NGIB组(P＜0.05)。上述结果表明，CPB术后患者的粪菌显著抑制了小鼠空肠与结肠屏障结构相关的基因表达；下消化道出血患者的粪菌，特别是术后粪菌对小鼠盲肠屏障结构相关的基因表达的抑制作用更加显著。<br>　　5.红细胞及血红蛋白参数：Post组小鼠血液中平均红细胞血红蛋白水平显著低于Pre组（P＜0.05）；GIB组小鼠血液中红细胞数量、血红蛋白量、平均红细胞血红蛋白量、红细胞比容显著低于NGIB组（P＜0.05）。这些结果表明，CPB术后患者的粪菌以及下消化道出血患者的粪菌致使小鼠发生了一定程度的贫血。<br>　　6.系统性炎性反应：相比于Pre组，Post组小鼠血液中白细胞、中性粒细胞数量显著升高（P＜0.05）；相比于NGIB组，GIB组小鼠血液中中性粒细胞、嗜酸性粒细胞的数量以及百分比显著增加，淋巴细胞百分比显著降低（P＜0.05）。此外，相比于Post-NGIB组，Post-GIB组小鼠血液中中性粒细胞的数量与百分比、嗜酸性粒细胞数量显著增加，淋巴细胞百分比显著降低（P＜0.05）。这些结果表明，CPB术后患者的粪菌以及下消化道出血患者的粪菌导致小鼠产生了系统性炎性反应，且下消化道出血患者的术后粪菌引起的炎性反应更加严重。<br>　　由于本实验条件下小鼠并未出现下消化道出血症状，有必要在缺血/再灌注条件下进一步证实下消化道出血与肠道菌群的因果关系。<br>　　研究二 肠缺血/再灌注条件下证实肠道菌群与下消化道出血的因果关系<br>　　为证实心血管体外循环手术后下消化道出血患者的粪菌与肠道出血的因果关系，选择6-8周龄雄性C57BL/6小鼠72只，随机分成3组，每组24只。用下消化道出血患者术前粪便（Pre-GIB-I，处理1组）与下消化道出血患者术后粪便（Post-GIB-I，处理2组）制备菌液。抗生素处理与菌液灌胃过程与研究一相同，以灌胃PBS溶液作为对照组（PBS-I组）。实验第14d，每组各取12只小鼠实施肠缺血/再灌注手术，屠宰全部小鼠并取样，检测肠道细胞因子表达等指标；结果如下：<br>　　1.体重变化与肠道出血：粪菌移植开始后第1d，处理2组小鼠体重显著高于处理1组，在第2d之后，处理2组小鼠体重低于处理1组以及对照组（P＜0.05）。表明下消化道出血患者的术后粪菌引发了小鼠更严重的体重损失。在肠缺血/再灌注手术后，对照组、处理1组、处理2组小鼠肠道中均充满了血，并发生了肠道渗透性出血。<br>　　2.肠道细胞因子表达：处理1组小鼠盲肠Il-12b和IFN-γ的基因表达显著高于对照组（P＜0.05）。处理2组小鼠空肠Il-1b、Il-17、TNF-α、IFN-γ；回肠IFN-γ及盲肠Il-1b、Il-12b、IFN-γ的基因表达显著高于对照组。特别是处理2组十二指肠Il-22；空肠Il-1b、Il-17、IFN-γ；回肠Il-1b、Il-17、Il-22、IFN-γ和盲肠Il-1b的基因表达均显著高于处理1组（P＜0.05）。这些结果表明，在肠缺血/再灌注条件下，CPB术后下消化道出血患者粪菌导致了更严重的肠道炎症反应，其中空肠和回肠的炎症反应更加明显，且术后粪菌的影响更加剧烈。<br>　　3.肠道紧密连接蛋白表达：相比于对照组，处理1组小鼠十二指肠ZO-1、ZO-2；空肠ZO-1、ZO-2、Occludin、Claudin-4；盲肠Occludin的基因表达显著降低（P＜0.05）；处理2组小鼠十二指肠ZO-1、ZO-2、Occludin；空肠ZO-2、Occludin、Claudin-4及回肠ZO-2、Occludin、Claudin-4的基因表达显著降低（P＜0.05）。特别是处理2组小鼠回肠ZO-2、Occludin基因表达显著低于处理1组（P＜0.05）。这些结果表明，在肠缺血/再灌注条件下，下消化道出血患者的粪菌显著抑制了肠道屏障结构相关的基因表达，且术后粪菌的影响更为显著。<br>　　4.肠道抗氧化酶活性：相比于处理1组，处理2组小鼠的盲肠超氧化物歧化酶活性与空肠过氧化氢酶活性显著降低（P＜0.05），表明在肠缺血/再灌注条件下，下消化道出血患者术后粪菌减弱了肠道抗氧化能力。<br>　　5.红细胞及血红蛋白参数：处理2组小鼠血液中平均红细胞血红蛋白量显著低于对照组（P＜0.05），平均红细胞血红蛋白水平显著低于处理1组（P＜0.05），表明下消化道出血患者术后粪菌加剧了肠缺血/再灌注造成的贫血。<br>　　6.系统性炎性反应：相比于对照组与处理1组，处理2组的小鼠血液中中性粒细胞百分比显著升高，淋巴细胞百分比显著降低（P＜0.05），表明下消化道出血患者术后粪菌加剧了肠缺血/再灌注造成的细菌性感染。<br>　　综上所述，本研究的主要结论是：<br>　　1.心血管体外循环辅助手术引起患者肠道菌群紊乱，短链脂肪酸显著降低，增加了各肠段的炎性反应，导致肠上皮屏障结构损伤，是产生系统性的细菌性感染和贫血的重要原因。<br>　　2.心血管体外循环辅助手术导致的患者粪便菌群紊乱，会加剧肠道缺血/再灌注损伤，增加了空肠和回肠的炎性反应，并严重损害了肠上皮屏障功能，与术后下消化道出血具有因果关系。