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摘要肠外致病性大肠杆菌（ExPEC）是一种重要的人畜共患病原体。AcrAB-TolC泵是大肠杆菌最主要的主动外排系统，介导抗生素等多种底物的转运，与细菌耐药性密切相关。TolC作为一种跨外膜孔道蛋白，负责将底物跨膜转运至胞外。本实验室前期研究发现，tolC基因缺失显著降低ExPEC耐药性，而过表达外膜蛋白OmpX的ΔtolC株后可恢复细菌耐药性，但其机制尚不清楚。OmpX与TolC具有相同的跨膜β-桶状结构，OmpX是否可替代TolC与AcrA和AcrB形成主动外排泵发挥药物外排功能？其他类似结构的外膜蛋白是否也有相同的功能？为解决这些疑问，本研究通过生物信息学分析，选择OmpX、OmpC、OmpN、OmpW和PhoE5种具有β-桶状结构的外膜蛋白作为靶标，分析不同外膜蛋白过表达对ExPECΔtolC株耐药性的影响，并通过外排抑制试验、药物蓄积分析等探讨其作用机制。主要研究内容和结果如下：<br>　　1.试验菌株的构建以及其耐药性研究<br>　　以猪源ExPECPPECC042（WT株）或其ΔtolC株为亲本株，采用同源重组法构建ΔacrA株、ΔacrB株与ΔacrAΔtolC株；制备了ompC、ompN、ompW、phoE4种基因的重组表达质粒，分别电转化到ΔtolC、ΔacrA、ΔacrB和ΔacrAΔtolC株的感受态细胞中，构建过表达不同外膜蛋白的试验菌株。<br>　　生长曲线测定结果表明，外膜蛋白过表达并不影响其亲本株的生长速率。采用微量肉汤稀释法测定不同抗菌药物的最小抑菌浓度（MIC），评价试验菌株的抗菌药物敏感性，结果表明，tolC基因缺失显著增加ExPEC对大环内酯类、喹诺酮类与四环素类药物的敏感性，而ΔtolC株过表达5种不同外膜蛋白后均能回复ExPEC对三类药物的耐药性至WT株水平。<br>　　2.ΔtolC株过表达5种外膜蛋白后回复ExPEC耐药性的机制研究<br>　　在3类抗菌药物敏感性试验中加入亚抑菌浓度的外排泵抑制剂羰基氰氯苯腙（CCCP），检测试验菌株的外排活性。结果显示，CCCP并不影响ΔtolC株的药物敏感性，但可不同程度降低WT株及过表达不同外膜蛋白的ΔtolC株的药物敏感性。提示tolC基因缺失导致ExPEC失去药物外排能力，5种不同外膜蛋白过表达均可代偿缺失的TolC蛋白从而恢复ExPEC药物外排能力。<br>　　对ΔacrA株、ΔacrB株和ΔacrAΔtolC株及其不同外膜蛋白过表达菌株进行药物敏感性试验，结果显示：（1）与WT相比，ΔacrA株、ΔacrB株以及ΔacrAΔtolC株的MIC显著降低，与ΔtolC株相似，表明tolC基因缺失通过破坏AcrAB-TolC外排泵结构降低细菌耐药性；（2）对ΔacrA株、ΔacrB株以及ΔacrAΔtolC株过表达5种不同外膜蛋白后，MIC均无显著变化，表明在介导主动外排耐药机制时，5种不同外膜蛋白过表达均不能代偿AcrA和AcrB蛋白的缺失，对TolC蛋白缺失的代偿依赖于AcrA和AcrB的存在。<br>　　采用环丙沙星蓄积试验进一步验证WT株、ΔtolC株、ΔacrB株以及过表达不同外膜蛋白的ΔtolC株的药物外排能力。结果显示：（1）胞质内药物浓度以WT株最低，ΔacrB株最高；周质内药物浓度以ΔacrB株最低，ΔtolC株最高。（2）5种外膜蛋白的过表达均可导致ΔtolC株胞质和周质内药物浓度显著下降（P＜0.001）。表明AcrB失活时药物无法进入周质，蓄积在胞质内；TolC失活时，药物可以进入周质，但无法排出胞外；5种不同外膜蛋白过表达均可替代TolC蛋白与AcrA和AcrB形成外排泵恢复ExPEC的主动外排能力，将药物转运至周质并排出胞外。<br>　　采用尼罗红染料作为底物进行实时流出分析试验，检测试验菌株的外排活性。结果显示：初始未提供能量的100s内，各试验菌株的荧光强度基本无变化。给予能量刺激后，WT株及过表达5种不同外膜蛋白的ΔtolC株荧光强度均发生剧烈下降，而ΔtolC株、ΔacrB株以及过表达5种不同外膜蛋白的ΔacrB株荧光强度下降趋势均较小，进一步证实5种不同外膜蛋白均可替代TolC与AcrA和AcrB形成外排泵恢复ExPEC的外排活性。