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摘要随着中国军事与经济能力的逐步提高，越来越多的人由于工作、学习、旅游等原因前往海拔大于3000m的高原地区。高原由于低压性低氧等原因会引发急进人员发生高原病，严重者甚至危及生命。目前对于人体感知低氧环境并启动抗缺氧机制的过程尚不完全清楚，也缺乏有效的防治手段。初级纤毛是位于细胞表面的轴突状结构，近年来发现其具有感知外界化学、物理、机械等刺激并将信号传达至胞内，引发相关反应的功能。那么初级纤毛是否具有感知缺氧环境并启动人体抗缺氧损伤机制的功能呢？本论文以体外培养心肌细胞为对象，研究了初级纤毛做为心肌细胞氧感受器并启动胞内抗缺氧损伤机制的作用。<br>　　本论文采用H9C2心肌细胞系按以下六个步骤依序开展研究工作：1.将细胞放置于缺氧环境0、12h、24h、36h后，分别用CCK-8法检测细胞存活率、胞内ROS含量、LDH释放率、MDA含量、抗氧化物酶SOD和CAT酶活性等，根据检测结果确定缺氧模型的最佳缺氧时长；2.免疫荧光染色观察缺氧24h后初级纤毛的长度及发生率。使用RNA干扰法初级纤毛发生后检测缺氧前后胞内ROS含量、LDH、SOD和CAT酶活性。3.检测缺氧前后细胞内钙离子水平及TRPV4的蛋白和基因表达水平，使用TRPV4抑制剂HC-067047提前2h预处理细胞，检测抑制TRPV4及缺氧24h前后细胞内Ca2+水平、线粒体膜电位、ROS含量、LDH释放率和细胞存活率；4.免疫荧光探究初级纤毛与TRPV4之间的位置关系，检测干扰初级纤毛对TRPV4蛋白和基因表达的影响，干扰初级纤毛和HC-067047共同作用，检测缺氧24h前后细胞内的Ca2+水平、线粒体膜电位、ROS含量、LDH释放率、MDA含量、SOD和CAT酶活力。<br>　　本论文主要的得到以下实验结果：1.随着缺氧时间的延长，H9C2细胞存活率逐渐下降，在缺氧36h仅为72%。LDH、ROS、MDA、和抗氧化酶SOD、CAT酶活性均呈现随缺氧时间逐渐升高，在缺氧24h达到顶峰，接着逐渐下降的趋势。2.常氧时H9C2细胞的纤毛长度为1.35±0.42μm，纤毛发生率为51%，缺氧24h后纤毛长度达到2.30±0.67μm，纤毛的发生率达到71%，结果具有显著统计学差异（P＜0.01）。使用shRNA有效干扰了IFT88的蛋白和基因水平，干扰初级纤毛（sh组）后在常氧情况下H9C2细胞内的ROS水平相比于NC组的0h增长至4.5倍，缺氧24h后两组的ROS均有所上升，但是sh组依旧远远高于NC组。LDH与ROS趋势基本一致，即sh组在0h显著提高，缺氧24h后sh组显著高于NC组。SOD的酶活性在0h的NC组合sh组没有明显差异，缺氧24h后NC组SOD酶活性显著上升，sh组虽然也有所上升，但是相比于NC组显著下降。CAT的酶活性在0h时NC与sh组间无显著学差异，缺氧24h后NC组远高于0h水平，sh组增长幅度远低于NC组。3.Fluo-4/AM钙离子探针显示细胞缺氧后出现钙超载现象，WB和RT-PCR结果发现缺氧24h后TRPV4的蛋白和基因均被上调。预处理HC-067047后TRPV4的蛋白和基因均被抑制。使用HC-067047和缺氧共同作用，发现缺氧24h后Ca2+水平显著上升、线粒体膜电位下降、ROS的含量显著升高、LDH释放率显著增加、细胞存活率明显下降，说明在缺氧24h后H9C2细胞发生了明显的氧化损伤，但是加入HC-067047后上述指标均被显著逆转。4.免疫荧光结果证明TRPV4定位于初级纤毛之上。干扰初级纤毛后TRPV4的蛋白和基因均高表达。干扰初级纤毛和HC-067047共同作用于H9C2细胞，干扰初级纤毛并缺氧24h后导致的Ca2+水平上升、线粒体膜电位下降、ROS含量上升、LDH释放率增加、MDA含量增多、CAT和SOD酶活力的下降均被预处理HC-067047所逆转。<br>　　以上结果说明，H9C2细胞中初级纤毛作为氧感受器可以感知胞外缺氧环境，通过位于初级纤毛上的TRPV4通道介导Ca2+内流，影响线粒体膜电位，导致ROS含量变化进而调控抗氧化酶活性维持细胞内氧化与抗氧化平衡。本实验为阐述心肌细胞通过初级纤毛感知缺氧环境以及初级纤毛应对氧化应激的作用机制作出一定的理论基础，为治疗高原心脏病药物的研发提供了潜在药物靶点。