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摘要背景<br>　　肝细胞癌（HepatocellularCarcinoma，HCC）在我国的发病率较高，其危险因素包括乙型肝炎、丙型肝炎和饮酒等。肿瘤转移是包括HCC在内的多种恶性肿瘤的主要致死因素，但是其潜在的机制仍缺乏系统的研究。泛素化作为一种重要的蛋白质翻译后修饰类型已经被证实在多种肿瘤的转移过程中发挥了重要的作用。泛素化蛋白质组学是一种联合免疫沉淀和质谱技术的高通量检测蛋白质泛素化修饰水平和位点的方法。因此，通过泛素化蛋白质组学定量HCC转移过程中蛋白质的泛素化改变有助于HCC转移的机制研究和潜在药物治疗靶点的筛选。<br>　　目的<br>　　(1)建立一个能够快速、高效、低成本检测人类肿瘤组织中蛋白质泛素化修饰水平的高通量组学方法。<br>　　(2)描绘HCC转移过程中普通蛋白质组学和泛素化蛋白质组学的动态变化，筛选并预测影响HCC转移的E3泛素连接酶。<br>　　(3)探究E3泛素连接酶SYVN1对HCC生长和转移的影响。<br>　　(4)探究E3泛素连接酶SYVN1促进HCC转移的可能分子机制。<br>　　方法<br>　　(1)通过调整泛素化蛋白质组学实验过程中的蛋白质除盐方法、胰蛋白酶消化条件、TMT标记方法、多肽分馏方法、质谱液相分馏方法、质谱检测参数、搜库参数等寻找能在有限样本量条件下最大化泛素化修饰位点检出数目和最小化实验成本的各步骤最优实验方案。<br>　　(2)选取15个有血管侵袭的HCC患者和15个无血管侵袭的HCC患者。通过普通蛋白质组学检测30个HCC患者肿瘤组织和对应瘤旁组织的蛋白质表达量差异，通过泛素化蛋白质组学检测30个HCC患者肿瘤组织和对应瘤旁组织的蛋白质泛素化水平差异。比较有血管侵袭的HCC和无血管侵袭的HCC间肿瘤组织与对应瘤旁组织蛋白质泛素化强度比值的大小。利用在有血管侵袭的HCC和无血管侵袭的HCC间泛素化强度比值差异较大的蛋白质来预测与HCC转移相关的E3泛素连接酶。最后，构建蛋白质底物和对应E3泛素连接酶的拓扑网络并寻找关键的E3泛素连接酶。<br>　　(3)通过细胞增殖实验、裸鼠皮下瘤实验、裸鼠尾静脉注射肺转移瘤实验、脐静脉内皮细胞成管实验、transwell迁移实验和transwell侵袭实验等比较阴性对照组和E3泛素连接酶SYVN1表达干扰组的LM3和HUH7肝癌细胞系的生长、迁移和侵袭能力。<br>　　(4)通过蛋白质互作组学、免疫荧光、免疫共沉淀等筛选并验证SYVN1的相互作用蛋白。通过比较阴性对照组、SYVN1表达干扰组和SYVN1过表达组的LM3和HUH7肝癌细胞系中相关蛋白质底物的泛素化水平差异寻找SYVN1的可能底物蛋白。<br>　　结果<br>　　利用改进后的泛素化蛋白质组学我们在HCC中鉴定到了11913个泛素化修饰位点和4317个泛素化修饰蛋白。在所有鉴定到的11913个泛素化修饰位点中，有2852个位点在HCC中泛素化修饰增加，有74个位点在HCC中泛素化修饰减少。在所有鉴定到的4317个泛素化修饰蛋白中，有1102个蛋白在HCC中泛素化修饰增加，有17个蛋白在HCC中泛素化修饰减少。比较有血管侵袭的HCC和无血管侵袭的HCC，大部分的泛素化修饰位点（6106个）和泛素化修饰蛋白（3047个）在两组间均被鉴定到，但有血管侵袭的HCC拥有更多的独有泛素化修饰位点（3694个）和泛素化修饰蛋白（862个）。此外，肿瘤组织的总泛素化和多聚泛素化水平均高于癌旁组织。<br>　　将有血管侵袭的HCC与无血管侵袭的HCC进行比较发现信号强度明显增加的泛素化修饰位点有EEF2K的K447位、SMAD5的K64位和PLPBP的K254位等。信号强度明显降低的泛素化修饰位点有SMC3的K1059位、HMGN2的K64位和CDA的K51位等。通过将含有这些泛素化修饰位点的蛋白质进行E3泛素连接酶预测并构建网络拓扑图，发现E3泛素连接酶SYVN1处于网络拓扑结构的中心位置。普通蛋白质组学数据显示在有血管侵袭的HCC中肿瘤组织的SYVN1表达明显高于瘤旁组织，而在无血管侵袭的HCC中SYVN1的表达无差异。生存分析显示SYVN1高表达的HCC患者其预后相对SYVN1低表达的HCC患者更差。<br>　　无血清培养基体外培养的细胞增殖实验和裸鼠皮下瘤实验显示LM3和HUH7肝癌细胞的增殖速度与SYVN1的表达量呈正相关。通过transwell细胞迁移实验我们发现低表达SYVN1的LM3和HUH7肝癌细胞其迁移能力均弱于正常表达SYVN1的LM3和HUH7肝癌细胞。此外，低表达SYVN1的LM3和HUH7肝癌细胞促进HUVEC细胞成管的能力较正常对照组更弱且bFGF等血管生成相关基因的表达水平更低。尾静脉注射肺转移瘤实验发现SYVN1稳定敲降组的肝癌细胞相较正常对照组的肝癌细胞转移能力更弱。此外，transwell侵袭实验也发现SYVN1稳定敲降组的肝癌细胞相较正常对照组的肝癌细胞穿透基质胶的能力更弱。<br>　　蛋白质互作组学结果显示热休克蛋白家族的HSP90AA1、HSP90AB1和HSP90B1蛋白在LM3和HUH7细胞中均获得了较高的评分。此外，通过分析普通蛋白质组学数据我们还发现在HCC中SYVN1的表达量与HSP90AA1、HSP90AB1和HSP90B1的表达量呈现高度正相关。免疫共沉淀和免疫荧光实验均证实无论内源性还是外源性表达的SYVN1均与HSP90存在相互作用。然而，两种肝癌细胞系和293T细胞系中的泛素化实验均发现SYVN1的表达改变并不影响HSP90的泛素化。<br>　　泛素化蛋白质组学数据显示有血管侵袭的HCC中EEF2K的泛素化水平明显高于无血管侵袭的HCC。免疫印迹实验和GEPIA数据库的转录组数据分析结果均显示EEF2K在HCC中高表达。此外，通过数据库预测EEF2K的E3泛素连接酶正是SYVN1。最后，通过实验我们发现肝癌细胞中SYVN1的表达被抑制后EEF2K的泛素化水平降低。<br>　　结论<br>　　改进后的泛素化蛋白质组学能够从HCC样本中快速简便地检测出超过10000个蛋白质泛素化修饰位点。肝癌组织总泛素化修饰强度和多聚泛素化修饰强度均高于癌旁组织。有血管侵袭的HCC中EEF2K、TXNRD1、RASSF4等蛋白的泛素化修饰水平明显升高，经预测SYVN1可能是调控这些蛋白泛素化水平的E3泛素连接酶。SYVN1在两种肝癌细胞系的体外和体内培养条件下均能促进肿瘤细胞的增殖。SYVN1在两种肝癌细胞系中均能促进血管生成和增强肿瘤细胞的迁移、侵袭能力。SYVN1与HSP90之间存在相互作用但并不影响HSP90的泛素化。SYVN1促进EEF2K的泛素化。