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摘要本文从以下几个部分展开论述：<br>　　第一章 SAMD12基因内含子区(TTTCA)五核苷酸重复扩增突变导致家族性皮质肌阵挛性震颤癫痫1型<br>　　研究目的：<br>　　利用本团队长期积累的中国FCMTE家系资源，鉴定其致病基因。<br>　　研究方法：<br>　　本研究纳入20个中国FCMTE家系，利用Illumina Human Omini ZhongHua-8BeadChip基因芯片的单核苷酸多态位点和短串联重复序列作为标记，通过连锁分析及单体型分析，对其中11个大家系进行致病基因区间定位。利用来自4个不同家系8例FCMTE患者的全基因组测序数据，通过ExpansionHunter这一针对性探测多核苷酸重复扩增突变的生物信息学分析工具，在所定位的最小致病基因区间内，对短串联重复序列是否存在异常重复扩增突变进行检测。利用长片段PCR、重复引物PCR，对发现的候选多核苷酸重复扩增突变进行验证和家系内疾病基因共分离。<br>　　研究结果：<br>　　连锁分析及单体型分析发现11个FCMTE大家系的致病基因区间均被定位于8q24（LOD值：1.64-3.77，其中5个大家系的LOD值大于3.0，提示肯定连锁），证实这些家系均为FCMTE1型家系。取其致病基因区间的交集，将FCMTE1型的致病基因区间缩小到一4.9Mb区间：chr8:116842110-12175086。利用ExpansionHunter，在8例患者的全基因组测序数据中对上述最小致病基因区间内233个3-7核苷酸重复序列进行分析，发现SAMD12基因4号内含子区一个(TTTTA)五核苷酸短串联重复出现异常扩增，同时在其基因方向3’端发现一(TTTCA)五核苷酸重复扩增突变片段的插入。通过长片段PCR和重复引物PCR进行验证，发现该位点的突变结构为(TTTTA)exp(TTTCA)exp（exp：expansion，即扩增）。该突变在11个被定位的FCMTE1型大家系和另外7个无法定位的小家系中均被检测到，且完全与疾病共分离。正常人群筛查发现单独(TTTTA)exp的人群携带率约为3.36%（8/238），未在正常人群中检测到(TTTCA)exp。在一个FCMTE1型家系中，其突变结构为(TTTTA)36-39(TTTCA)exp，提示真正完全与疾病共分离的是(TTTCA)五核苷酸重复扩增突变。<br>　　研究结论：<br>　　SAMD12基因内含子区的(TTTCA)五核苷酸重复扩增突变是FCMTE1型的致病基因突变。该五核苷酸重复扩增突变，与既往报道的脊髓小脑共济失调37型的致病突变一致，提示其可形成异常转录的RNAfoci，通过其毒性作用导致疾病发生，具体发病机制仍有待进一步探索。<br>　　第二章 靶向长读长测序技术鉴定SAMD12基因(TTTGA)五核苷酸重复扩增突变为家族性皮质肌阵挛性震颤癫痫1型一新的致病突变<br>　　研究目的：<br>　　明确一个未检测到(TTTCA)exp的FCMTE家系的遗传致病病因。<br>　　研究方法：<br>　　一个前期SAMD12、TNRC6A和RAPGEF2基因(TTTCA)exp检测均为阴性的FCMTE家系被纳入本研究。重复引物PCR、长片段PCR、Sanger测序被应用于该家系以确认候选致病基因突变。基于PacBio RSⅡ测序平台，利用长片段PCR产物进行目标区域的靶向长读长测序，确认新发现致病突变的具体序列与结构。<br>　　研究结果：<br>　　在该FCMTE家系发现SAMD12基因内含子区一个新的(TTTGA)五核苷酸重复扩增突变与疾病共分离。对该家系内两名患者（Ⅱ:6和Ⅲ:4）、一名无症状突变携带者（IV:2）以及一个之前报道过携带SAMD12基因(TTTCA)exp的FCMTE患者（家系Ⅰ-Ⅲ:2，作为阳性对照）进行目标区域的靶向长读长测序，分别获得了302条、159条、207条和50条跨过重复扩增序列区且准确度大于90%的subreads。经过统计分析,该家系的重复扩增突变详细结构为：(TTTTA)114-124(TTTGA)108-116，(TTTCA)exp阳性对照家系Ⅰ-Ⅲ:2的重复扩增突变详细结构为：(TTTTA)38(TTTCA)479。<br>　　研究结论：<br>　　目标区域靶向长读长测序准确解析了(TTTTA)exp(TTTGA)exp和(TTTTA)exp(TTTCA)exp两种不同多核苷酸重复扩增突变的详细结构。我们的发现进一步扩大了SADM12基因相关FCMTE的突变谱系，提示在(TTTCA)exp检测阴性的情况下，还要关注可能存在如(TTTGA)exp的其他重复扩增序列突变的可能性。<br>　　第三章 家族性皮质肌阵挛性震颤癫痫1型的脑结构及功能改变<br>　　研究目的：<br>　　利用多模态磁共振成像技术，探索基因确诊的FCMTE1型患者的脑结构及功能改变。<br>　　研究方法:<br>　　纳入了31例基因确诊携带SAMD12基因杂合(TTTCA)五核苷酸重复扩增突变的FCMTE1型患者及31例年龄、性别匹配的健康对照。采用多模态磁共振成像技术，包括：基于体素的形态学分析、弥散张量成像的各项异性分数、静息态功能磁共振BOLD信号的多频段振幅百分比（percent amplitude of fluctuation，PerAF）及基于种子点的功能连接，进行两组人群的对比分析。<br>　　研究结果:<br>　　在FCMTE1型患者组发现显著的右侧小脑CrusⅡ灰质体积减少。PerAF分析发现在小脑蚓部Ⅷ、左侧小脑脑叶Ⅷ及左中央前回3个脑区存在显著的“频段/组间”交互效应。小脑两个脑区出现了极低频段PerAF的升高，左中央前回出现了极高频段PerAF的降低。上述PerAF结果使用支持向量机算法，鉴别两组人群有82%的准确率（p=1.0-5）。左侧小脑脑叶Ⅷ的PerAF值与皮质震颤病程呈正相关。基于种子点的功能连接分析提示在患者组，小脑蚓部Ⅷ和左中央前回功能连接增强。<br>　　研究结论:<br>　　FCMTE1型患者的小脑出现了结构和功能的改变，小脑极低频段PerAF升高和运动皮层极高频段PerAF降低可能是FCMTE1型的病理生理特点之一。<br>　　第四章 JAM2基因双等位基因功能缺失突变导致原发性家族性脑钙化<br>　　研究背景：<br>　　原发性家族性脑钙化（Primary Familial Brain Calcification，PFBC）是一组以双侧对称性脑钙化（基底节区为主）为影像学特征，可有帕金森症、构音障碍、共济失调等临床表现的运动障碍疾病。目前已有4个常染色体显性遗传致病基因（SLC20A2、PDGFRB、PDGFB和XPR1）和1个常染色体隐性遗传致病基因（MYORG）被鉴定发现。遗传筛查发现，在一半以上的PFBC患者中，无法检测到已知致病基因的突变，提示存在未被鉴定发现的PFBC致病基因。<br>　　研究目的：<br>　　本研究拟在排除上述已知致病基因的基础上，鉴定新的PFBC致病基因。<br>　　研究方法：<br>　　根据PFBC的诊断标准，自2016年5月起共纳入399个排除已知致病基因突变致病的PFBC家系或散发患者。通过纯合子定位和全基因组测序，在1个父母近亲结婚的家系发现新的PFBC候选致病基因。通过Sanger测序在另外398个PFBC家系的先证者或散发患者对候选致病基因进行筛查验证。对检测到的新致病基因突变，构建质粒转染的中国仓鼠卵巢（Chinese hamster ovary，CHO）细胞模型，通过蛋白免疫印迹和免疫荧光进行突变的相关功能研究。利用公共数据库对新致病基因的组织和特定细胞类型表达情况进行分析。<br>　　研究结果：<br>　　在2个父母近亲结婚的PFBC家系和1个散发患者发现JAM2基因的双等位基因突变，包括两个纯合突变（纯合移码突变c.140delT，p.L48*、纯合起始密码子突变c.1A＞G，p.M1?）和一对复合杂合突变[杂合错义突变c.504G＞C，p.W168C和2-4号外显子杂合缺失突变c.(67+1_68-1)_(394+1_395-1)del，p.Y23_V131delinsL]。构建含上述突变JAM2基因的质粒，转染CHO细胞后进行蛋白免疫印迹和免疫荧光实验，发现转染了c.140delT，p.L48*突变JAM2质粒和c.1A＞G，p.M1?突变JAM2质粒的CHO细胞中，均未生成JAM2蛋白；c.504G＞C，p.W168C突变JAM2质粒翻译形成的JAM2蛋白无法在细胞膜表达；c.(67+1_68-1)_(394+1_395-1)del，p.Y23_V131delinsL突变JAM2质粒翻译出一段缺失了重要功能域的截短JAM2蛋白。上述功能研究提示4个突变均引起了JAM2基因功能缺失。在一个神经血管单元（Neurovascular Unit,NVU，血脑屏障的基本结构和单位）相关细胞的单细胞测序数据库中对JAM2进行表达分析后，发现和多个已知PFBC（PDGFB、PDGFRB和MYORG）或其他伴脑钙化的单基因遗传病致病基因（JAM3和OCLN）一样，JAM2在NVU相关细胞（内皮细胞和星形胶质细胞）中有高表达。<br>　　研究结论：<br>　　本研究鉴定了一个新的常染色体隐性遗传PFBC致病基因JAM2。JAM2双等位基因功能缺失突变可能导致NVU相关细胞功能异常，进一步支持NUV的功能异常可能是PFBC重要致病机制。