细胞外基质在肝脏生理和病理组织中的生物学作用及其应用研究-论文-万方医学网

细胞外基质在肝脏生理和病理组织中的生物学作用及其应用研究

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摘要本论文共分为三个部分，第一部分探究了细胞外基质（Extracellularmatrix，ECM）在组织工程中的应用，并以ECM为基础开发了一种新的生物墨水，通过数字光处理（Digitallightprocessing，DLP）3D打印工艺制备了肝脏微组织。第二部分探究了肝癌（HepatocellularCarcinoma，HCC）疾病中ECM的变化趋势，以ECM为特征构建了一个预测HCC患者预后的模型，并在此基础上探究了ECM与HCC肿瘤微环境之间的相互关系。第三部分是第二部分工作的延申，我们发现ECM相关基因ADAM9与肝癌的TP53突变有着明显的相关性，因此在第三部分做了相关可能机制的探索。我们通过细胞学实验验证了该结论，发现TP53的GOF突变（Gain-of-Function，GOF）可以调节ADAM9的改变，从而影响HCC的肿瘤生物行为，这为HCC患者治疗提供了一个有价值的新靶点。 　　第一部分 　　实验目的: 　　肝移植是终末期肝病唯一有效的治疗方法，同时也是治疗各种肝脏良恶性肿瘤的最有效方法之一，但受制于肝源紧缺，尤其是国内缺口巨大、且价格昂贵，绝大部分患者得不到最佳的诊治。因此，亟需一种肝移植的替代产品，可以填补肝源缺口。近年来，肝脏组织工程在再生领域取得了快速的发展，但纵观近几年的成就可以发现，目前人造肝脏还缺乏与原生组织相似的微环境，且无法还原组织精细的三维结。因此，如果能提出一种新的基质材料以及一种新的配套制备工艺，便可以实现制备与原生肝组织接近的体外肝脏组织。 　　实验方法: 　　首先，为了营造与原生组织类似的微环境，我们从巴马猪肝中提取制备了肝脏细胞外基质（Liverextracellularmatrix，LECM），同时加入甲基丙烯酸明胶（MethacrylateGelatin，GelMA），开发出肝脏特异性生物墨水（ECM/GelMAbioink），以期实现水凝胶的固化。我们对开发得到的ECM/GelMAbioink进行了机械性能、生物性能的表征测定。随后将ECM/GelMAbioink装载人源诱导型肝样细胞（Humaninducedhepatocytes，hiHep），形成细胞负载的生物墨水，利用DLP的生物打印技术，制备了肝脏微组织，并通过肝功能指标验证肝脏微组织的生物代谢合成功能。 　　最后，我们通过质谱分析对LECM的组分进行了探究，以明确LECM促进hiHep细胞生长的机制。 　　实验结果: 　　通过洗脱猪肝中的细胞成分，我们制备得到的LECM，不仅完整去除了细胞成分，还实现了对ECM成分的完整保留。我们将LECM和GelMA按一定比例混合得到的ECM/GelMAbioink，通过力学性能、溶胀性和细胞相容性等体外表征发现，LECM/GelMA在体外不仅拥有优秀的机械性能，还能更好地促进hiHep细胞在体外生长。随后在利用基于DLP的生物打印技术制备肝脏微组织的过程中，我们发现肝脏ECM可以提高GelMA生物墨水的打印性能和细胞活力。在微组织中，细胞拥有良好的铺展性，并具有更好的肝细胞特异性功能（白蛋白分泌和尿素）。质谱结果显示，肝脏ECM中含有促进细胞生长和黏附等相关的生物大蛋白，这提示肝脏ECM可能参与了肝脏细胞的生长与黏附。 　　实验结论: 　　我们的研究结果为肝脏微组织的制造提供了一种新思路，基于LECM的细胞负载生物墨水可以很好地模拟肝脏微组织。基于该肝脏特异性生物墨水，我们设计了一种具有内部齿轮状结构的仿肝小叶的新型肝脏微组织，并通过体外实验证明该微组织具有部分肝脏功能。我们研究成果可为肝脏组织工程产品的制备提供一种新手段，使其成为一种潜在的肝脏组织工程产品，可以有效地帮助恢复肝脏功能。 　　第二部分 　　实验目的: 　　HCC是全球死亡率最高的癌症类型之一，其主要原因是HCC具有很强的异质性，因此需要频繁的随访和精确的预后预测系统来评估临床治疗的效果。但临床现有的评价体系基于传统的大体分型，无法满足肿瘤精准治疗的需要。因此，亟需一种能结合传统的肿瘤评估和瘤内异质性的新颖评分系统，以助于准确预测HCC的预后。 　　实验方法: 　　我们分析了癌症基因组图谱数据库（TheCancerGenomeAtlas，TCGA）的371例HCC患者转录组数据，描绘了ECM基因在HCC进展中的改变，以此为基础，通过LASSO回归分析（Leastabsoluteshrinkageandselectionoperator）建立了HCC预测模型，并在GEO数据库、ICGC数据库以及浙江大学医学院附属邵逸夫医院HCC数据集进行了验证。最后我们通过寻找ECM相关基因和免疫检查抑制点、缺氧相关基因，以及与TCGA外显子数据的相关关系，探究了ECM基因与肿瘤微环境、肿瘤突变基因之间的关系。 　　实验结果: 　　我们发现在HCC进展过程中ECM发生动态改变。对此，我们基于18个ECM相关基因构建了HCC预后预测模型，在三个验证数据集进行了验证，发现基于ECM特征的预测模型可以较好预测HCC患者的总体生存（OverallSurvival，OS）以及无病生存时间（DiseaseFreeSurvival，DFS）。此外，我们通过对免疫检查抑制点基因进行分析以及与缺氧评分的相关性分析，发现ECM相关基因与肿瘤微环境有着明确的相关性。同时通过TCGA外显子数据，我们发现ECM基因与TP53突变有较密切的联系。 　　实验结论: 　　我们基于大数据分析构建了一个ECM的风险评分，这个风险评分可以预测HCC患者的预后。同时我们还发现肿瘤分泌的ECM蛋白影响肿瘤微环境中免疫信号、缺氧状态和TP53突变状态。TP53突变与ECM相关分子的相关性可能为HCC的精准治疗提供了新视角。 　　第三部分 　　实验目的: 　　编码p53蛋白的TP53是抑癌基因，却也是人类肿瘤中突变最频繁的基因，其突变往往会丧失对肿瘤活性的抑制作用，促进肿瘤转移进展。而肿瘤转移进展过程中会发生ECM重塑，ECM的重塑与肿瘤恶性生物行为有着密切的联系。 　　实验方法: 　　基于第二部分研究结果，我们首先通过TCGA数据库中HCC数据集比较了TP53突变与ADAM9的表达量之间存在相关性，并在细胞水平上敲减/过表达TP53的水平，以探究ADAM9表达的改变。 　　实验结果: 　　基于TCGAHCC数据集，我们发现HCC中的TP53突变会影响ADAM9的表达水平，这种改变在TP53GOF突变时最为明显（p＜0.05）。通过敲减/过表达改变PLC-8024（TP53GOF）以及HepG2（TP53WT）细胞的TP53水平，我们发现ADAM9与TP53GOF的水平显著相关，但TP53WT的水平并不能影响ADAM9的表达水平。 　　实验结论: 　　我们的工作发现，TP53突变可以通过改变ADAM9的表达水平重塑肿瘤微环境，进而促进肿瘤进展。由于目前临床上针对TP53突变治疗被证明具有挑战性，因此针对其下游进行靶向治疗可能颇具价值，有望有效用于HCC的治疗。